胆汁酸核受体FXR在卵巢癌细胞中的作用机制研究

发布时间：2020-07-17 11:57

【摘要】：背景卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤,由于传统的卵巢癌治疗方法效果不佳,因此寻找新的治疗靶点对卵巢癌的治疗具有重要意义。信号转导和转录活化因子3(STAT3)信号通路在细胞的分化、生长、凋亡过程中发挥着重要作用。目前研究报道在卵巢癌中检测出STAT3信号通路异常活化,并且降低STAT3水平可以抑制卵巢癌的生长和迁移。因此对卵巢癌中STAT3信号通路的研究具有十分重要的意义。法尼酯衍生物X受体(FXR)是一种胆汁酸核受体,对机体的多种生理功能起到调控作用。子宫内膜异位症是卵巢癌的一种发病原因,研究报道FXR可以通过调控STAT3信号通路来作用子宫内膜异位症。但关于FXR在卵巢癌中的作用目前还未见报道,因此在本论文中我们针对FXR在卵巢癌细胞中的作用及其具体机制展开研究。目的本篇论文通过体内外实验揭示FXR对卵巢组织和人卵巢癌细胞的作用,以及具体分子机制。方法体内实验:模型Ⅰ:选取9-10周龄的FXR基因敲除(FXR KO)雌性小鼠和C57BL/6J野生型雌性小鼠,确保发育完全并采用无激素饲料喂养,避免交配产生个体差异。收集血清样本,提取卵巢组织中的RNA和组织蛋白,通过实时定量PCR、ELISA和蛋白印迹实验探究FXR敲除对于小鼠卵巢和体内雌激素水平的具体影响。模型Ⅱ:选用高成瘤率的人卵巢癌细胞SKOV3进行异体肿瘤移植实验,BALB/c裸鼠无胸腺,具有T细胞免疫缺陷。培养状态良好的SKOV3细胞,将5×10~6个细胞重悬于150μL的PBS中,种植在裸鼠腋窝皮下,5天左右可见成瘤,之后随机分组进行腹腔给药。实验组注射FXR激动剂GW4064,GW4064溶解于DMSO(6 mg/mL),根据体重计算每只小鼠注射药量为(30 mg/kg),对照组注射DMSO,使用游标卡尺测量肿瘤大小。两天为一周期给药,给药同时测量瘤体大小,共给药8个周期。最后一次给药结束后处死裸鼠,取出瘤体,并对瘤体进行Ki67的免疫组化染色,评估瘤体增殖程度。异体肿瘤移植实验探究腹腔注射FXR激动剂对移植卵巢癌肿瘤的影响。体外实验:表型实验:本课题所用到的细胞系为人卵巢癌细胞系SKOV3与OVCAR8,实验组加入GW4064进行处理,对照组加入DMSO。首先进行MTT实验,SKOV3细胞使用1μM和2μM的GW4064进行处理,OVCAR8的药物浓度为0.5μM和1μM。通过记录激动剂处理后不同时间点的OD值来探究FXR激动剂对卵巢癌细胞增殖的影响;其次进行细胞划痕实验,实验设计和MTT实验相同,记录不同时间点实验组和对照组的细胞划痕愈合程度,探究FXR激动剂对于卵巢癌细胞迁移的影响;最后使用GW4064处理SKOV3细胞48 h,并回收包括死细胞在内的所有细胞,进行Annexin-V-FITC/PI双染实验,用流式细胞仪检测FXR激动剂对人卵巢癌细胞凋亡的影响。机制研究:依据表型实验选取适宜的药物浓度进行进一步的分子机理研究。SKOV3细胞使用2μM的GW4064进行处理,OVCAR8使用的药物浓度为1μM。首先,使用GW4064处理卵巢癌细胞24 h,提取细胞的RNA,并测量相关的炎症基因和凋亡基因,探索FXR激动剂对于人卵巢癌细胞基因水平的调控;其次,使用GW4064处理卵巢癌细胞24 h,并使用人IL-6(10 ng/mL)处理6 h以激活STAT3信号通路。提取细胞总蛋白,进行蛋白印迹实验,检测p-STAT3(Tyr705)水平的变化,以确定GW4064对卵巢癌细胞中STAT3信号通路的影响,探究FXR激动剂对人卵巢癌细胞STAT3信号通路的调控。反向验证实验:购买FXR的小干扰RNA,转染人卵巢癌细胞,测量FXR的mRNA水平,选用干扰效果最明显的siRNA,进行MTT实验,检测细胞增殖情况。结果1、在FXR KO小鼠的卵巢组织中,IL-2、IL-4、INF-γ等炎症基因的表达水平高于野生型小鼠;并且p-STAT3(Tyr705)蛋白的表达水平也高于野生型小鼠;FXR KO小鼠血清中雌二醇水平低于野生型小鼠(P0.05)。2、在体外成瘤模型中,实验组小鼠腋下肿瘤组织的生长速率、肿瘤体积和增殖指标明显低于对照组(P0.05)。3、表型实验结果显示,激活FXR可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移,并且能够促进卵巢癌细胞的凋亡(P0.05)。4、FXR激活后能够抑制卵巢癌细胞中的炎症基因Cox-2、MMP2、IL-6、IL-4、MCP-1的表达(P0.05),并上调促凋亡基因p53、p21、p27(P0.05)、Caspase3、c-Myc、Bax(P0.01)的表达;在蛋白水平上,能抑制IL-6诱导的p-STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化(P0.05)。5、FXR的siRNA干扰FXR表达的同时可以促进卵巢癌细胞的生长(P0.05)。结论1、FXR基因敲除后小鼠卵巢组织STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化和部分炎症因子的mRNA水平上调,血清雌二醇水平下降。2、FXR激动剂GW4064通过抑制人卵巢癌细胞中的STAT3信号通路来负向调控炎症因子的表达,并上调促凋亡基因的mRNA水平,从而引起卵巢癌细胞的凋亡,并抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。3、FXR激动剂GW4064能够通过腹腔吸收来抑制异体移植卵巢癌细胞的生长。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
【图文】：

柱状图,血清雌二醇,蛋白磷酸化,水平图

图 3-1 FXR KO 上调小鼠卵巢部分炎症基因，促进 STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下调血清雌二醇水平图 3-1，FXR 的缺失可以上调小鼠卵巢的部分炎症基因，促进 STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化，并下调血清雌二醇水平。（A）为 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠卵巢组织 IL-2、IL-4、INFγ 基因的 mRNA 水平，提示 FXR KO 小鼠卵巢组织部分炎症基因相对于野生型 WT小鼠出现上调。（B）为 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠每只个体卵巢组织的蛋白灰度条带，提示 FXR KO 小鼠个体的卵巢组织中 STAT3(Tyr705)蛋白磷酸化水平普遍高于 WT 组。（C）为不同基因型小鼠卵巢组织组内融合蛋白的灰度条带，提示融合相同基因型小鼠卵巢组织蛋白，总体来看 FXR KO 上调了 STAT3(Tyr705)蛋白的磷酸化。灰度分析使用每个样品的 p-STAT3(Tyr705)蛋白灰度除以各自对应的总 STAT3 蛋白灰度，得出图 C 中的柱状图（。D）为 FXR KO 小鼠和 WT 小鼠组内血清雌二醇水平的平均值，提示 FXR KO小鼠的血清雌二醇水平水平低于 WT 小鼠。（*：P<0.05，n=5）

柱状图,血清雌二醇,蛋白磷酸化,水平图

异体移植,卵巢癌细胞,激动剂

图 3-2 FXR 激动剂 GW4064 抑制异体移植卵巢癌细胞的生长图 3-2，GW4064 抑制异体移植肿瘤的生长，并降低肿瘤的增殖程度。（A）为次给药结束后整体状况，可见 GW4064 处理组肿瘤体积小于对照组，两组裸鼠明显差异。（B）为完整剥离出的肿瘤情况，可见实验组肿瘤体积小于对照组。药同时测量的肿瘤体积，结果可见实验组肿瘤生长速度低于对照组。（D）为光下肿瘤组织免疫组化 Ki67 的结果（a、b 放大倍数为 400 倍），实验组肿瘤组织率要低于对照组，提示实验组肿瘤组织的增殖程度低于对照组。每个样品在光下各取 20 个不同视野，统计 Ki67 阳性率，并求取平均值。（*：P<0.05，n=5由体内实验得知，FXR 基因敲除可以上调小鼠卵巢组织部分炎症基因的表T3(Tyr705)蛋白的磷酸化水平，并且 FXR KO 降低小鼠血清雌二醇水平。GW

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