高糖经LncRNA-GAS5影响子宫内膜癌进展的机制研究

发布时间：2020-07-17 16:07

【摘要】：目的:子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma,EC)是女性常见的恶性肿瘤之一,合并肥胖、糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)、高血压皆是高危险族群,近几年发病率呈逐年上升,并且发病人群越来越年轻化。临床上,主要的治疗方法是手术切除,但治疗后复发率和死亡率仍较高、预后差。临床实践中发现,EC患者中DM是普遍存在的伴发疾病,长期高血糖状态增加EC的发生和发展危险。LncRNA(long non-coding RNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,在多种肿瘤中异常表达,通过多种机制调控肿瘤的发生发展,被证实为恶性肿瘤形成的重要的基因表达调控器。长链非编码RNA生长阻滞特异性转录物5(LncRNA Growth arrest-specific transcript 5,LncRNA GAS5)在乳腺癌、胃癌、宫颈癌等肿瘤中低表达,过表达GAS5可抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期,目前关于GAS5在DM合并EC中的研究并不多,因此本研究探讨GAS5在DM促进EC发展过程中的作用及机制。方法:1、根据生物信息学预测影响EC生存期的指标,收集并统计天津中心妇产医院2017年5月-2018年2月新发的EC患者的病历资料,将所有EC患者依据是否合并DM分为单纯EC组和DM合并EC组,对两组患者的临床病理特点比较,采用qRT-PCR检测两组癌组织中GAS5和miR-222-3p的表达,同时分析其与临床病理特点的关系和各指标之间的关系。2、体外培养EC细胞株HEC-1A和Ishikawa,采用不同浓度的葡萄糖(5.5mM、15mM、20mM、25mM),干预EC细胞48h,利用qRT-PCR检测GAS5和miR-222-3p的表达变化,构建GAS5过表达载体,和miR-222-3p抑制剂,应用CCK-8实验、克隆形成及Transwell侵袭实验检测细胞增殖、克隆形成及侵袭作用。3、在不同高糖浓度下,采用qRT-PCR检测P27的表达,利用核质分离试剂盒检测GAS5在Ishikawa细胞中的亚细胞定位,使用双荧光素酶实验验证GAS5和miR-222-3p及miR-222-3p和P27(CDKN1B)的关系;过表达GAS5和上调miR-222-3p共同转染Ishikawa细胞后,检测miR-222-3p和P27表达的变化,使用Western blot检测P27蛋白的表达变化。结果:1、利用生物信息学,挑选出与EC相关的LncRNA GAS5进行研究,与高表达GAS5的EC患者相比,低表达GAS5的EC患者远期预后差,生存期缩短(P=0.072)。临床资料分析,DM合并EC组的患者初诊时,肿瘤FIGO分期和组织分级都高于单纯EC组,且更容易发生淋巴结转移(P0.05)。在EC组织中GAS5呈低表达,且下降程度与是否合并DM、肿瘤组织分级、FIGO分期和淋巴结转移有关。与单纯EC组相比,DM合并EC组的癌组织中GAS5的表达量更低(P0.05);与癌旁正常子宫内膜相比,EC合并与不合并DM患者miR-222-3p的表达均升高,且DM合并EC组的患者miR-222-3p的表达升高更多,其上升程度与肿瘤FIGO分期和淋巴结转移有关(P0.05),两组中GAS5与miR-222-3p之间均呈负相关关系(P0.05)。2、与正常子宫内膜细胞相比,HEC-1A及Ishikawa细胞中,GAS5的表达水平明显下调,而miR-222-3p的表达水平明显上调(P0.01)。随着高糖浓度的增加,GAS5的表达呈下降趋势,而miR-222-3p的表达呈上升趋势(P0.05)。过表达GAS5质粒转染进EC细胞系内,并稳定表达;体外细胞生物学行为研究发现,高糖(25mM)能够促进EC细胞增殖、增强克隆形成和侵袭能力,而过表达GAS5或者抑制miR-222-3p后都可逆转高糖诱导的EC细胞的增殖、克隆形成及侵袭(P0.01)。3、在HEC-1A及Ishikawa细胞中,P27的表达水平明显下调(P0.01),随着高糖浓度的增加,P27的表达呈下降趋势(P0.05)。在Ishikawa细胞中GAS5在细胞浆的表达量高于细胞核;双荧光素酶实验结果提示GAS5与miR-222-3p存在结合位点,两者能直接调控,而P27(CDKN1B)可以与miR-222-3p结合。与对照组相比,过表达GAS5后,miR-222-3p的表达量下降,P27的表达水平上升(P0.01);上调miR-222-3p后,P27 mRNA和蛋白水平均下调;而过表达GAS5同时上调miR-222-3p后,P27 mRNA和蛋白水平出现了明显减少(P0.01)。结论:1、DM可能会通过影响EC的分期分级、淋巴结转移,促进肿瘤的进展、影响患者的预后,LncRNA GAS5可能作为EC患者的一个预后指标。2、GAS5和miR-222-3p可能在DM合并EC中起着重要作用,过表达GAS5或抑制miR-222-3p后,可逆转高糖诱导的EC细胞的增殖、克隆形成及侵袭能力。3、高糖经LncRNA GAS5/miR-222-3p通过调控P27影响EC细胞增殖和侵袭。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

宫内膜癌,患者,子宫内膜癌,中位

图 1 高表达/低表达 GAS5 对子宫内膜癌患者的生存影响.2 DM 组和 NDM 组子宫内膜癌患者的临床病理参数比较共有 36 例子宫内膜癌患者被纳入本次研究，其中单纯子宫内膜癌患者，合并糖尿病患者 9 例。中位年龄 52.5 岁（53.1±9.22 岁，32-70 岁）；重指数 25.8kg/m2（25.4±2.35kg/m2，20.4-29.1kg/m2）；其中糖尿病合并膜癌患者中位年龄 50.0 岁（49.1±7.43 岁，36-60 岁），中位体重指数 26.3k26.2±1.62kg/m2，23.1-28.4kg/m2），单纯子宫内膜癌患者中位年龄 54.0 岁（

子宫内膜癌,形态变化,HE染色,腺上皮细胞

天津医科大学博士学位论文注：*P＜0.05，**P＜0.011.2.3 DM 组和 NDM 组子宫内膜癌患者组织的形态学特点两组癌旁组织中子宫内膜的腺体轮廓平滑、无增生，腺上皮细胞的顶缘光滑、平整，不具有异型性。DM 组子宫内膜癌组织的腺体实性生长明显，腺上皮细胞多为呈簇状突入腔内，复层或多层，细胞大小不一，核圆形、椭圆形、卵圆形、不规则形，核仁清晰，染色质粗颗粒状，部分细胞核空亮，核分裂易见。NDM 组子宫内膜癌组织中增生的腺体形成复杂的纠缠的管道，轮廓不规则，腺上皮细胞呈放射状衬在极细的质网架上，间质减少，具有腺上皮细胞异型性，细胞核增大、变圆、不规则、失去极向，核仁明显，胞浆丰富嗜酸性。（见图 2）

子宫内膜癌,癌组织,相关性分析,患者

NCECDMDM+EC012345****NDM组 DM组 CTvalue(mir-222expression)图 4 miR-222-3p 在 DM 组和 NDM 组子宫内膜癌患者组织中的相对表达量注：DM 组中 DM+EC 为癌组织，DM 为癌旁组织；NDM 组中 EC 为癌组织NC 为癌旁组织。*P＜0.05，**P＜0.01

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