维生素D对卵巢癌中肿瘤相关巨噬细胞效应与机制研究

发布时间：2020-07-18 20:11

【摘要】：目的:上皮型卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的筛查方法,60-90%的患者发现时已发展至晚期。卵巢癌的进展与免疫系统密切相关。肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境的重要组成部分,对卵巢癌的进展起着重要作用。现有的研究发现活性维生素D可以改变肿瘤相关巨噬细胞的极化方向。课题组前期研究发现活性维生素D可以抑制卵巢癌的发展。为了研究活性维生素D是否可以通过改变肿瘤相关巨噬细胞的极化,影响卵巢癌的进展,本研究使用活性维生素D处理M1型、M2型肿瘤相关巨噬细胞,并用它们的上清液(即条件培养基)培养卵巢癌细胞。通过体内、体外实验观察活性维生素D刺激巨噬细胞获得的条件培养基是否会对卵巢癌细胞的生物学特性产生影响。初步探讨活性维生素D作用于肿瘤相关巨噬细胞后影响卵巢肿瘤细胞特性的可能机制,为活性维生素D用于卵巢癌防治提供可靠的实验数据。方法:(1)通过循证医学的方法证明肿瘤相关巨噬细胞在卵巢癌病人肿瘤组织中浸润的密度与患者预后是否存在相关性:通过“卵巢癌”、“巨噬细胞”、“肿瘤相关巨噬细胞”等关键词在PubMed与MEDLINE数据库中检索相关文献,收集肿瘤相关巨噬细胞浸润密度与患者预后的风险比(Hazard Risk,HR)。通过meta-analysis分析肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤组织中浸润的阳性率与卵巢癌患者预后的关系。计算合并后的HR以及95%置信区间(Confidence Interval,CI)。(2)活性维生素D通过肿瘤相关巨噬细胞对卵巢癌细胞生物学特性的影响:使用流式细胞分析仪检测体外极化的M1型、M2型肿瘤相关巨噬细胞标志物。用活性维生素D刺激M1型、M2型肿瘤相关巨噬细胞,收集条件培养基,用肿瘤相关巨噬细胞的条件培养基培养卵巢癌细胞。使用CCK-8法检测卵巢癌细胞的活性;使用平板克隆实验检测卵巢癌细胞增殖能力的变化;使用划痕与Transwell实验检测卵巢癌细胞迁移能力的变化。将肿瘤相关巨噬细胞与荧光标记的卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下,观察其致瘤能力的变化,以及小鼠生存期的变化。从体内、体外实验说明活性维生素D是否通过肿瘤相关巨噬细胞对卵巢癌细胞生物学特性产生影响。(3)活性维生素D通过肿瘤相关巨噬细胞影响卵巢癌细胞生物学特性的机制:用ELISA法检测活性维生素D处理肿瘤相关巨噬细胞得到的条件培养基,检测TGF-β1、TNF-α、IL-1β、MMP-9含量变化;收取不同巨噬细胞蛋白样品,通过western blot法,检测活性维生素D处理后巨噬细胞VDR表达水平的变化;检测不同条件培养基培养的卵巢癌细胞中EGFR、β-catenin表达水平的变化,进一步阐明活性维生素D通过肿瘤相关巨噬细胞对卵巢癌细胞生物学特性产生影响的可能机制。结果:(1)卵巢癌组织中M2型肿瘤相关巨噬细胞是卵巢癌病人预后的危险因素最终纳入文献8篇,合并病例961例。结果显示肿瘤相关巨噬细胞阳性率可以引起卵巢癌病人的不良预后(HR 1.78,95%CI 1.19~2.66)。由于结果的异质性较大,所以我们进行了亚组分析与敏感性分析。亚组分析结果发现,M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤组织中的阳性率与病人不良预后呈正相关。敏感性分析结果发现,剔除其中一篇文献后,分析结果的异质性明显下降。(2)活性维生素D刺激M2型肿瘤相关巨噬细胞的条件培养基可以降低卵巢癌细胞的增殖与迁移能力细胞活性实验结果显示,活性维生素D刺激M1型细胞得到的条件培养基可以促进SKOV-3细胞的增殖,而活性维生素D刺激M2型细胞得到的条件培养基培养的SKOV-3细胞的活性却被抑制了。平板克隆实验结果显示,活性维生素D对M1型巨噬细胞培养基刺激的卵巢癌细胞增殖能力无影响(p0.05)。但是,活性维生素D可以通过影响M2型巨噬细胞的培养基降低卵巢癌细胞的增值能力(p0.05)。划痕实验结果显示,用活性维生素D刺激M1型巨噬细胞得到的条件培养基可以促进卵巢癌细胞迁移能力,并且迁移能力随时间延长而增加,在48小时时达到最大值(p0.05)。而用活性维生素D刺激M2型巨噬细胞得到的条件培养基在不同时间均抑制卵巢癌细胞的迁移能力(p0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示,活性维生素D刺激的巨噬细胞与卵巢癌细胞共同接种裸鼠皮下、且每周肌肉注射维生素D_3,生存率较对照组显著提高。以上体内、体外实验结果说明,活性维生素D可以通过改变M2型肿瘤相关巨噬细胞的培养基,降低卵巢癌细胞的增殖与迁移能力(3)活性维生素D通过与肿瘤相关巨噬细胞的VDR结合,间接地影响了卵巢癌细胞蛋白表达Western blot结果显示活性维生素D可以调节M2型巨噬细胞VDR的表达,进而降低巨噬细胞TGF-β1、MMP-9、TNF-α,增加IL-1β的分泌。同时,活性维生素D刺激M2型巨噬细胞的条件培养基可以抑制卵巢癌细胞β-catenin的表达量,最终抑制卵巢癌细胞的增殖与迁移能力。说明活性维生素D的条件培养基抑制卵巢癌细胞的增殖与迁移,与增加M2型巨噬细胞VDR表达、减少TGF-β1、MMP-9、TNF-α,增加IL-1β的表达有关。以上实验结果说明,活性维生素D可以通过调节M2型肿瘤相关巨噬细胞的蛋白分泌,改变卵巢癌细胞的生物学特性。结论:(1)肿瘤组织M2型肿瘤相关巨噬细胞阳性率是卵巢癌病人预后的危险因素;(2)活性维生素D处理M2型肿瘤相关巨噬细胞后,可以降低卵巢癌细胞的增殖与迁移能力;并提高裸鼠的生存时间;(3)活性维生素D通过与肿瘤相关巨噬细胞VDR结合,降低TGF-β1、TNF-α、MMP-9的表达,促进IL-1β的表达,间接地影响了卵巢癌细胞β-catenin的表达,抑制了卵巢癌细胞的生物学特性。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

肿瘤相关巨噬细胞与卵巢癌病人预后的meta-analysis森林图

图 1.2 M2 型肿瘤相关巨噬细胞与卵巢癌病人预后的亚组分析森林图2.5 敏感性分析为了寻找导致 meta 主分析异质性的文献，我们又进行了敏感性分析，即将

图 2.1 PMA 对 THP-1 细胞形态以及标志物的影响THP-1 细胞经 PMA 刺激，A: 细胞形态直观图，细胞贴壁生长，形态接近“卵圆形”；B: PMA 刺激后，巨噬细胞标志物 CD68 表达上升。为了观察维生素 D 是否影响 M1 型和 M2 型巨噬细胞表面标志物的表达情况，

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本文编号：2761371