Furin在分娩启动中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-21 13:12

【摘要】：早产全球发生率平均高达百分之十,是造成新生儿死亡的首位原因,幸存者成年后也会遗留一系列并发症。因此,研究早产发生的机理,控制其发生发展刻不容缓。人类分娩是一个复杂且物种特异性的过程,导致至今仍未能阐明分娩启动的调控机制,因而临床上依然没有能有效防治早产的手段。为此,我们收集临床足月未临产以及足月临产各十例人子宫肌样本进行第二代测序。全转录组分析结果发现,在足月临产的人子宫肌里FN14、Furin以及SULF1与足月未临产存在明显差异。其中Furin蛋白作为前蛋白转化酶,可作用于众多底物,参与了包括癌症、动脉粥样硬化以及由细菌或病毒引起的感染等诸多疾病过程。那么探究高表达的Furin在子宫激活中所发挥的作用,将有助于解释人类正常分娩启动及早产的分子机制。因此本课题我们将围绕Furin对子宫肌激活的调控机制展开探讨。首先从临床上收集人妊娠相关组织样本(子宫肌、绒毛膜和羊膜),进一步明确在人类分娩启动时Furin的表达水平是否发生改变。而后我们利用原代培养的子宫平滑肌细胞,探究Furin对子宫平滑肌细胞收缩力的影响。考虑到人体样本的伦理要求以及体外实验的局限性,我们构建正常妊娠以及感染性/非感染诱导的小鼠早产模型,从而在整体动物水平上探究Furin在分娩启动发生过程中的作用。通过以上探索,将为临床防治早产寻找治疗靶点提供新思路。主要实验结果如下:一、人足月临产子宫肌组织中Furin表达水平显著升高1.RNA-seq检测数据表明人足月临产子宫肌中Furin、FN14和SULF1的表达较足月未临产升高最为显著。2.进一步RT-PCR、Western blotting以及IHC检测结果表明在人临产子宫平滑肌组织中Furin mRNA及蛋白水平表达较足月未临产明显上调。3.但临产前后人绒毛膜和羊膜组织中Furin表达差异无统计学意义。二、Furin调控子宫肌细胞中收缩相关蛋白的表达及细胞收缩力1.Furin siRNA敲低Furin表达后,原代培养的子宫平滑肌细胞中收缩相关蛋白OTR、CX43、FP、COX2以及p-P65和p-MLC20均表达下调。2.Furin抑制剂CMK处理以及转染Furin siRNA后细胞收缩力均显著降低。3.细胞转染Furin OVE过表达慢病毒后细胞收缩力增强。综上表明Furin可促进人子宫肌细胞中UAPs的表达并增强细胞收缩力。三、妊娠末期抑制小鼠体内Furin表达可推迟其正常分娩1.RT-PCR与Western blotting检测结果表明在小鼠妊娠第19d以及临产时子宫平滑肌组织中Furin mRNA及蛋白表达水平较妊娠第15d、17d均有明显上调2.在ICR小鼠妊娠第17.5d/18.5d分别大腿肌肉注射Furin抑制剂CMK或D6R(1mg/kg)后,均可明显推迟小鼠正常分娩。且D6R对分娩启动的推迟作用呈剂量依赖性。3.受高剂量D6R影响延迟分娩的小鼠子宫肌组织中Furin蛋白表达差异无统计学意义,但收缩相关蛋白中除了OTR差异无统计学意义之外,COX2、CX43以及FP均表达下调。4.受高剂量D6R影响延迟分娩的小鼠子宫肌组织可见糖原异常聚集、内质网扩张、平滑肌中出现异常空泡和自噬泡,以及细胞核有固缩,存在凋亡倾向,并伴有部分肌丝断裂。由此表明Furin参与了正常妊娠的分娩启动。四、探寻Furin参与分娩启动的可能分子机制(一)两种早产模型小鼠子宫肌中Furin均未被激活1.RU38486诱导的无菌性早产时,小鼠子宫肌中Furin未被激活,Furin抑制剂CMK和D6R均不能推迟其早产。2.LPS诱导的炎症性早产时,小鼠子宫肌中Furin也未被激活,Furin抑制剂D6R也不能推迟其早产。(二)Furin通过活化TWEAK-FN14途径激活NFκB通路调节UAPs的表达1.Furin抑制剂D6R处理、转染Furin siRNA以及Furin OVE后细胞上清中人27因子含量均无明显改变。2.Furin抑制剂D6R处理以及转染Furin siRNA后细胞上清中TWEAK含量均减少,同时D6R处理后细胞中全长TWEAK蛋白表达增多。3.细胞转染Furin OVE后细胞上清中TWEAK含量增多。4.小鼠妊娠末期肌注Furin抑制剂D6R(1.5mg/kg)后,血清中TWEAK含量降低,子宫肌中差异无统计学意义。5.Furin抑制剂D6R处理细胞后,磷酸化P65表达降低,而给予TWEAK处理后,磷酸化P65表达却升高。6.RT-PCR,Western blotting及IHC检测结果均提示足月临产时TWEAK的受体FN14在人子宫肌中表达明显上调,而绒毛膜和羊膜中表达差异无统计学意义。7.子宫肌细胞转染FN14 siRNA后,细胞中收缩相关蛋白OTR、CX43、FP及COX2均表达下调。8.在转染FN14 siRNA以及FN14拮抗剂(L524-0366)处理后细胞收缩力均显著降低,而给予TWEAK处理后细胞收缩力却增强。9.与妊娠第17d相比,妊娠第19d以及临产时小鼠子宫肌中FN14的表达都有显著上调。同时抑制FN14可明显推迟小鼠正常分娩。10人原代子宫平滑肌细胞转染FN14 siRNA后,细胞中p-P65及p-MLC20均表达降低。综上表明Furin可通过剪切活化TWEAK,触发TWEAK-FN14途径,进而激活NFκB通路导致人子宫肌细胞中UAPs表达上调和细胞收缩力增强,最后引起分娩启动的发生。结论1.前蛋白转化酶Furin特异性在足月临产的子宫肌中表达增多,其可促进子宫平滑肌细胞中UAPs的表达。在整体动物模型上,Furin抑制剂可显著推迟小鼠正常分娩的发生,但不能影响无菌性以及炎症性早产的发生。提示Furin可能直接影响子宫平滑肌的收缩力而启动了分娩的发生。2.TNFR超家族成员FN14也特异性在足月临产子宫肌中表达上调。同时Furin可切割其配体TWEAK并促其活化,TWEAK-FN14途径可促进转录因子P65的磷酸化并增加UAPs的表达,进而增强细胞收缩力。在整体动物水平进一步证实,抑制FN14可以明显推迟小鼠正常分娩的发生。提示TWEAK-FN14可能通过激活NFκB通路参与分娩启动。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.21
【图文】：

子宫肌,妊娠相关,转录组,测序

学硕士学位论文实验结果一节人妊娠相关组织中 Furin 的表达及分布人足月未临产和足月临产子宫肌组织全转录组测序寻人足月未临产与足月临产子宫肌组织中的差异基因，我们收集临床足足月临产各十例人子宫肌组织样本进行第二代测序。结果发现，在足月肌里 Furin、SULF1 以及 FN14 等基因的表达较足月未临产均有显著升

子宫肌,水平表

Furin 在分娩启动中的作用及其机制研究- 29 -图2. 人足月未临产和足月临产的子宫肌中SULF1、Furin、HIF1A等 mRNA水平的表达。（A-D，G）RT-PCR 结果显示人足月临产时 SULF1、Furin、FN14、NNMT 及 INMT mRNA 水平表达上调；（E-F）RT-PCR 结果显示人足月未临产与临产 NNMT 和 TBSH mRNA 水平表达差异无统计学意义。n=9 , E: P=0.62, F: P=0.22 , * P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001.Fig 2. The level of SULF1、Furin、HIF1A mRNA in myometrium during human pregnancy andlabor. (A-D,G) The level of SULF1, Furin, FN14, NNMT and INMT mRNA were up-regulated inhuman term labor; (E-F) The level of TBSH and HIF1A mRNA were not significantly differentbetween the two groups. Data are presented as mean±SEM. n=9 in each group. E: P=0.62, F: P=0.22 ,*P<0.05,** P<0.01, ***P<0.001 compared with pregnant women who are non-labor.二、人足月未临产和足月临产子宫肌组织中 PCs 表达（一）人足月未临产及足月临产子宫肌中 PCs 其他成员 mRNA水平的表达RNA-seq 结果表明 Furin、SULF1 及 FN14 在足月未临产和临产间表达存在显著差异，同时 RT-PCR 结果显示 Furin、SULF1 及 FN14 mRNA 水平在临产时显著上调。而 Furin 又可剪切活化 SULF1, 同时 FN14 的配体 TWEAK 也可被 Furin 剪切活化，于是我们推测 Furin 在分娩启动中起了重要作用，Furin 便成了我们研究的重点。考

子宫肌,成员,家族

海军军医大学硕士学位论文虑到前蛋白转化酶家族各成员间较高的同源性，为探明 PCs 家族其他成员在人类妊娠过程子宫肌中 mRNA 表达情况，我们从临床收集足月未临产以及足月临产人子宫肌样本，抽提组织总 RNA, 进行 RT-PCR 检测各成员表达情况。结果显示，其他成员表达差异均无统计学意义（图 3）。

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