DNA甲基化对胎儿血红蛋白表达影响的初步研究

发布时间：2020-07-24 08:26

【摘要】：目的:探讨γ珠蛋白基因(HBG)启动子区甲基化状态对轻型β-地中海贫血胎儿血红蛋白(HbF)表达的影响;对全基因组的甲基化位点进行生物信息学分析,筛选出可能与HbF表达相关的差异甲基化基因、生物信号通路,为β-地中海贫血治疗提供新的靶点和理论基础。方法:收集301例轻型β-地中海贫血患者的外周抗凝静脉血各2ml。提取DNA后对其进行亚硫酸氢盐转换,PCR扩增含有目的甲基化位点的片段,用焦磷酸测序方法,定量检测HBG启动子区的甲基化程度,分析HBG启动子区甲基化状态与HbF表达的相关性。收集足月产新生儿脐血8例、早产新生儿脐血8例,通过磁珠分选方法提取新生儿脐血中的有核红细胞,提取DNA后对其进行亚硫酸氢盐转化,采用Illumina Infinium?Human Methylation850 Bead Chip芯片,对全基因组甲基化位点进行检测。依次采用R软件minfi包、R软件IMA包处理原始数据,筛选出两组间的差异甲基化位点、差异甲基化基因(筛选差异甲基化位点的标准为:差异显著p值0.05,|beta.difference|0.14),对其进行GO功能分析、KEGG通路分析与Hb F表达相关的基因和信号通路。结果:由于HBG1和HBG2具有高度同源性,两者启动子区的CpG位点一致,HBG启动子区共包含5个甲基化位点,分别为-53、-50、+5、+16、+49位点。在定量分析上5个位点的甲基化程度与HbF的表达均无显著相关性(p0.05)。在定性分析上,5个位点均呈现出高度甲基化或中度甲基化,未发现低甲基化。根据HbF的表达量对标本进行分组,组间甲基化程度没有显著性差异(p0.05);根据甲基化程度对标本进行分组,仅+49位点不同甲基化程度的HbF表达量有显著性差异(p0.05);其它4个位点不同甲基化程度的HbF表达量均没有显著性差异(p0.05)。llumina 850K芯片技术检测结果:相对于早产组,足月组共筛选差异甲基化位点4749个,包括低甲基化位点4359个,高甲基化位点390个;差异甲基化位点对应差异甲基化基因2600个。差异基因经GO分析显示与造血相关的生物过程:正向调节Wnt信号通路共富集到4个差异基因(ABL2、DAB2、ANKRD6、MLLT3),在足月组中均为低甲基化;KEGG分析显示与造血相关的Nothch通路上共富集到14个差异基因,低甲基化的基因有11个(CREBBP、PSEN2、KAT2B、LFNG、CTBP2、MAML3、DTX3L、NUMB、NOTCH1、HDAC1、RBPJ),高甲基化的基因有3个(NCOR2、MAML2、PTCRA)。结论:轻型β-地中海贫血患者HBG启动子区呈高度或中度甲基化,抑制HbF的表达,但两者之间在定量水平上没有显著相关性;全基因组甲基化芯片生物信息学分析发现Wnt和Notch信号通路可能与HBG的表达调控有关,为后续进一步研究HBG的表达调控机制提供了新的研究靶点。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.54
【图文】：

甲基化,启动子区,预测结果,位点

所以在预测甲基化岛时，结果一致，如图 1-1 所示：在 HBG 基因动子区（TSS 上游-2000bp~TSS 下游 200bp）没有预测到符合条件的 CpG 岛是在启动子区 5,248,392~5,248,641（Human GRCH38/hg38）（-137，+113）存 5 个甲基化位点（-53、-50、+5、+16、+49），结合文献[28]，本实验将这 5 个基化位点作为研究靶点。

位点,甲基化,标本,试剂

1-2 ：建好的程序，检测 1~8 号标本（-53、-50）位点、（+5、+16）位点、+49 点共 40 个位点的甲基化程度igure1-2：Builted New Run,detection 40 methylation sites of 1~8 samples’-53、-50、++16、+49sites测序引物的稀释及试剂仓的加样用试剂 Annealing Buffer 将焦磷酸测序引物稀释至 0.3μM，并吸取 25.4μl Run 中待测位点对应的测序引物至 Q24 反应板中。分别向对应的试剂仓足量的酶：E，底物：S，碱基：A、T、G、C，以备测序时用。单链的分离打开真空工具开关，将振摇的八联管打开盖子并放入仪器上，将真空工具联管中持续 20s，以捕获 PCR 产物；将真空工具快速放入试剂槽 1（70%）中冲洗 10s；将真空工具放入试剂槽 2 变性溶液（PyroMark Denaturation so洗 10s；再将真空工具放入试剂槽 3 洗涤液（PyroMark Wash Buffer）中冲

分布图,探针,分布图,甲基化

图 2-1：基因、CpG 岛注释分类后的探针分布图2-1:The probe distribution of annotated classification map of Gene、Cp甲基化基因的 GO 富集分析选出的差异甲基化区域涉及的所有基因进行 GO 分析，通过生得到相应条目富集到的基因。筛选差异 DMR（different met同区域甲基化）相关基因中显著富集的 GO 条目，其计算公所有基因中具有 GO 注释的基因数目；n 为 N 中差异 DMR 相为所有基因中注释为某特定 GO term 的基因数目；m 为注释的差异 DMR 相关基因数目。计算得到的 p-value 通过 Bonfe corrected p-value（FDR）≤0.05 为阈值，满足此条件的 GO te

【相似文献】