羊膜间充质干细胞联合雌激素治疗宫腔粘连的体外实验研究

发布时间：2020-08-01 10:14

【摘要】：目的:研究不同浓度雌二醇(estradiol,E_2)对体外培养人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)增殖、凋亡的影响,探索hAMSCs分化为子宫内膜样细胞的潜能及条件。方法:(1)采用组织贴壁法和改良酶消化法提取hAMSCs;通过流式细胞学和免疫荧光对第3代hAMSCs进行鉴定。酶消化法提取人子宫内膜间质细胞(hEStCs),通过免疫荧光对h EStCs进行鉴定。(2)采用不同浓度E_2作用于h AMSCs;CCK8(cell counting kit-8,CCK8)试剂盒测定各组hAMSCs的增殖情况;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)检测细胞分化、凋亡相关基因的表达情况;蛋白印迹法(Western blotting,WB)检测凋亡相关蛋白的表达情况。(3)采用条件诱导培养基和transwell共培养方法分别分组培养第3代h AMSCs,培养7天后,qRT-PCR检测上皮特异性基因(CK7、EMA),间质特异性基因(Vimentin),蜕膜化标志基因(IGFBP-1)的表达情况,进一步采用WB检测上皮特异性蛋白(CK18),间质特异蛋白(Vimentin),蜕膜化标志性蛋白(PRL)的表达情况。结果:(1)通过改良酶消化法提取、传代,获得大量纯化可稳定增殖的hAMSCs用于后续研究。(2)各浓度E_2组在1-4天的增殖率与对照组无明显差异,在4天后,各浓度E_2组的增殖率明显高于对照组(p0.05),各浓度组间无明显差异;1×10~(-6)mol/l E_2组hAMSCs的干细胞相关基因(Oct-4)、抗凋亡基因(Bcl-2)表达水平较对照组和其他E_2浓度组上调(p0.05),1×10~(-5)mol/l E_2组hAMSCs的促凋亡基因(Bax)较对照组和其他E_2浓度组上调(p0.05);1×10~(-6)mol/l E_2组hAMSCs的促凋亡蛋白(Bax)较其他浓度E_2组显著下调(P0.001)。(3)细胞因子组和细胞因子+E_2组hAMSCs的细胞形态由原本的粗短梭形变为细长梭形;细胞因子组hAMSCs的上皮特异性基因(CK7、EMA)较对照组表达上调(P0.05),细胞因子组和细胞因子+E_2组hAMSCs的上皮特异性蛋白(CK18)、蜕膜化标志性蛋白(PRL)较对照组显著上调(P0.01),而间质特异性蛋白(Vimentin)较对照组显著下调(P0.01);共培养组hAMSCs的上皮特异性基因(CK7)、蜕膜化标志性基因(IGFBP1)较对照组表达上调(P0.05),而间质特异性基因(Vimentin)较对照组表达下调(P0.05)。结论:(1)改良酶消化法可获取大量hAMSCs;(2)E_2促进hAMSCs的增殖呈时间依赖性,高浓度E_2(10~(-5)mol/l)促进hAMSCs凋亡,较高浓度E_2(10~(-6)mol/l)能够维持hAMSCs活性并保护其分化潜能;(3)hAMSCs在细胞因子(TGF-β1+EGF+PDGF-BB)或transwell共培养h EStCs所提供的微环境中能够向子宫内膜上皮细胞分化,而E_2对这种分化效应的作用并不显著。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R711.74
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2 鉴定分离提取的 hAMSCs流式细胞学检测第 3 代 hAMSCs，结果显示细胞表面标记 CD29、CD90 表达率分别为 98.17 ±0.76%、98.83±0.68%；造血干细胞表面标记 CD45 表达率为 0.05±0.49%(图 2 C)；免疫荧光法检测第 3 代 hAMSCs 的 Vimentin、CK18 蛋白表达情况，结果显示 Vimentin 表达阳性，CK18 表达阴性(图 2A、B)。

鼠或兔的二抗(1：5000 稀释)，室温孵育 1 小时，TBST 洗 3 次，ECL 荧色，暗室中用高敏感 X 线胶片曝光显影。统计学分析计方法同第二部分。果胞因子联合 E2诱导 hAMSCs 后细胞形态学改变置相差显微镜下观察显示：hAMSCs 在诱导分化组(细胞因子、细胞因子+形态发生较大改变，细胞由原本的粗短梭形的成纤维细胞样变为细长的，呈放射状分布，增殖能力较对照组更好。hAMSCs 在只添加 E2组的细对照组变化不明显(图 7)。

37A、上皮细胞特异基因 CK7 的 mRNA 表达；B、间质细胞特异基因 Vimentin 的 mRNA 表达；C、蜕膜化标记物 IGFBP-1 的 mRNA 表达。注：*为 P＜0.05；**为 P＜0.01.图 10: Transwell 共培养 hEStCs 诱导 hAMSCs 分化后基因表达情况Fig.10：The mRNA expression of hAMSCs by by co-culture with hEStCs表 8:各组中 CK7、Vimentin、IGFBP-1 的 mRNA 表达水平(n=3, x±s)Tab 8:The mRNA expression of CK7、Vimentin and IGFBP-1 in each group(n=3, x±s)组别 CK7 Vimentin IGFBP-1对照组 1.097 ±0.330 1.324 ±0.232 1.079 ±0.260Transwell 组 3.467 ±0.013 0.564 ±0.125 4.643 ±0.969P 值 0.002 0.045 0.023

【参考文献】

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本文编号：2777327