NR4A1参与TGF-β介导的卵巢子宫内膜异位症纤维化的研究

发布时间：2020-08-05 08:53

【摘要】：子宫内膜异位症是最常见的妇科疾病之一,主要临床症状表现为痛经和不孕,目前临床上对于子宫内膜异位症缺乏理想的保守治疗方案,而单纯依赖于手术。这使得寻找确切的治疗靶点,控制子宫内膜异位症所导致的不孕成为了生殖内分泌疾病研究者一直追求的目标。组织学上,卵巢异位的子宫内膜腺体和基质被致密的纤维组织所包围。一方面,这些过多的纤维组织会导致慢性疼痛并且影响输卵管的拾卵功能。另一方面,卵巢的皮质区也可能被纤维组织包裹从而导致卵泡储备减少。TGF-β是一种参与组织纤维化的关键因子,在子宫内膜异位症患者的腹腔液和血液中均有TGF-β的高表达,并介导了子宫内膜异位症的纤维化。NR4A1是类固醇/甲状腺激素受体超家族中的一员,参与了细胞凋亡、糖脂代谢等各种生物学行为。已有研究表明,在硬皮病中NR4A1能够负反馈调控TGF-β信号通路从而抑制其下游基因的表达。尚不清楚NR4A1是否在TGF-β介导的子宫内膜异位症纤维化过程中起到调节作用。本研究旨在探索NR4A1是否参与了卵巢子宫内膜异位症的发病过程,以及是否与卵巢子宫内膜异位症中TGF-β介导的纤维化病变有关。通过验证NR4A1在子宫内膜异位病灶中的表达变化,及探索其参与子宫内膜异位症纤维化的相关作用机制,最终寻找有效的针对子宫内膜异位症纤维化的潜在治疗靶点。本研究主要分为以下三个部分:第一部分:NR4A1及P-NR4A1在人卵巢异位内膜组织及小鼠异位病灶形成过程中的表达实验目的:检测人卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织NR4A1及P-NR4A1的表达差异,以及裸鼠异位内膜不同时间点NR4A1及P-NR4A1的表达变化,揭示其与Qg异症发病过程的关系。实验方法:采用Western Blot和免疫组织化学染色的方法,分析23例人卵巢异位内膜和15例正常子宫内膜中NR4A1和P-NR4A1的表达差异。建立30只裸鼠子宫内膜异位症模型,随机分为6组,每组5只,并分别在建模第0、3、5、7、14、21天随机处死一组小鼠,搜集小鼠异位病灶,行免疫组织化学染色法,分析裸鼠异位内膜病灶形成过程中NR4A1和P-NR4A1的表达变化。实验结果:Western Blot和免疫组化的结果显示23例人卵巢异位内膜和15例正常子宫内膜中NR4A1的含量并无显著差异,但P-NR4A1在异位内膜中的含量明显高于正常内膜。裸鼠异位病灶免疫组化染色结果显示,在异位病灶的形成过程中,异位组织内P-NR4A1的表达随时间增加。实验结论:NR4A1参与了子宫内膜异位症的发病过程,其在Qg异症异位病灶形成的过程中发生了磷酸化。第二部分:NR4A1参与了子宫内膜异位症中TGF-β介导的纤维化过程实验目的:探索NR4A1在TGF-β介导的卵巢子宫内膜异位症纤维化中的作用机制。实验方法:分离培养原代卵巢异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞,在TGF-β刺激后,提取细胞内总蛋白,行Western Blot和免疫荧光染色法观察NR4A1和P-NR4A1在间质细胞中的表达变化。构建NR4A1的si RNA,并将转染NR4A1si RNA的间质细胞暴露于TGF-β刺激下,提取细胞内RNA,采用实时定量荧光PCR(q RT-PCR)法分别检测实验组和对照组纤维化相关基因的表达。在NR4A1敲除的小鼠中构建子宫内膜异位症模型,21天后处死小鼠并收集异位病灶,通过Sirius red和Masson染色观察病灶的纤维化程度。将AKT的磷酸化抑制剂MK2206作用于间质细胞,并将细胞暴露于TGF-β的持续刺激下,通过Western Blot观察NR4A1发生磷酸化的程度。实验结果:在长期的TGF-β刺激下,间质细胞NR4A1的表达先增高后出现降低,但P-NR4A1的表达持续增高。在TGF-β刺激下,NR4A1低表达的细胞较对照组纤维化相关基因的表达增高。敲除NR4A1后,小鼠异位病灶的纤维化程度也明显加重。MK2206能够有效抑制TGF-β诱导下的NR4A1的磷酸化。实验结论:NR4A1在TGF-β长期刺激下发生磷酸化失活,从而促进子宫内膜异位症纤维化的发生,AKT通路参与了这一过程。第三部分:Csn-B能有效抑制子宫内膜异位症的纤维化过程实验目的:探索NR4A1能否作为子宫内膜异位症纤维化的潜在药物治疗靶点。实验方法:培养原代卵巢异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞,在TGF-β刺激前,在细胞培养液中加入NR4A1的激动剂壳囊孢菌素B(Csn-B),24小时后提取细胞内RNA,采用实时定量荧光PCR(q RT-PCR)法分别检测实验组和对照组纤维化相关基因的表达。构建裸鼠子宫内膜异位症模型,将20小鼠随机分为两组,一组注射Csn-B,另一组注射对照溶剂DMSO。21天后处死裸鼠并收集异位病灶,通过Sirius red和Masson染色观察病灶的纤维化程度。实验结果:Csn-B能有效降低TGF-β刺激下间质细胞内纤维化相关基因的表达。相比于对照组,Csn-B注射的裸鼠纤维化程度也明显降低。实验结论:Csn-B能够有效降低子宫内膜异位症的纤维化程度。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R711.71
【图文】：

异位子宫内膜,子宫内膜,免疫组织化学,病灶

华中科技大学博士学位论文四、实验结果1.NR4A1 在人异位子宫内膜中的表达没有发生变化为了验证 NR4A1 在异位子宫内膜和正常子宫内膜中的表达是否存在差异，我们收取了23例子宫内膜异位症患者的异位内膜组织和15例原发性不孕患者的正常内膜组织，通过提取组织总蛋白，Western Blot 结果表明：NR4A1 在异位子宫内膜和正常子宫内膜中的表达并无显著差异。免疫组织化学染色同样提示：NR4A1 在异位子宫内膜中的表达较之正常对照组并没有发生变化。

异位子宫内膜,内膜,病灶,磷酸化

2.P-NR4A1 在人异位子宫内膜中的表达增高NR4A1 是孤儿核受体超家族的一员，其对生理病理机制的调节除了可以通过改变本身的表达量以外，还可以通过磷酸化等修饰作用来达到。为了验证 NR4A1 在异位子宫内膜和正常子宫内膜中是否发生了磷酸化修饰，我们通过 Western Blot 检测组织标本中 NR4A1 的磷酸化程度。结果表明：P-NR4A1 在人异位子宫内膜的表达较正常子宫内膜显著增高。免疫组织化学染色同样提示：P-NR4A1 在人异位子宫内膜中的表达比正常内膜更高。

裸鼠,病灶,异位子宫内膜,免疫组织化学染色

华中科技大学博士学位论文3.NR4A1 在裸鼠异位内膜病灶形成过程中的表达变化对裸鼠建模后第 0、3、5、7、14、21 天的异位内膜病灶组织行免疫组织化学染色后，统计染色强度分析结果显示： NR4A1 的表达量在裸鼠异位内膜病灶形成的第3 天开始增高，第 14 天开始下降，第 21 天的表达量仍然高于第 0 天的表达。

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