卵巢早衰的相关因素分析及WT1、DMC1基因在卵巢早衰发病机制中的作用研究

发布时间：2020-08-12 15:17

【摘要】：第一部分中国汉族卵巢早衰相关因素分析背景：卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是以女性40岁以前原发性或继发性闭经,不孕,促性腺激素升高(FSH40IU/L)、雌激素降低及生殖器官萎缩等围绝经期表现为特征的内分泌疾病。女性过早闭经(40岁)可导致卵巢激素水平急剧下降并出现严重的围绝经期症状,患者的生理、心理均受到严重的影响。目前已明确部分POF病因,包括基因和染色体异常、自身免疫性因素、病毒感染、环境和医源性因素(如盆腔手术和放、化疗病史)等,但大部分POF患者病因仍不清楚。POF病因的复杂性和异质性增加了早期诊断和预防的难度。POF确诊时卵巢功能多已发生不可逆性损伤,因而如何早期预测发生风险及早做出诊断尤为重要。研究目的：本研究选取大样本中国汉族POF患者进行问卷调查,从社会学特征、既往病史、环境因素及生活习惯四个方面探讨POF发病的相关因素,以期发现POF的危险因素,预测POF的高危人群,做到早预防、早诊断和早治疗。研究方法：募集2008年～2013年就诊于山东大学附属生殖医院的553例POF患者和400例对照组女性,对其进行一对一专人问卷调查。对参与者的社会学特征、月经史、生育史、既往病史、环境因素和生活习惯等进行单因素和多因素Logistic回归分析,计算OR值(odds ratios, OR)、95%可信区间(95%confidence intervals,95% CI)和P值。结果：553例POF患者中,65例(65/544,11.95%)为原发性闭经,479例(479/544,88.05%)为继发性闭经。基本社会学特征(职业、学历等)未发现与POF的发病有相关性(P0.05)。环境因素方面,居住和/或工作环境装修、经常接触农药和化学试剂等有毒物质的女性更易患POF,较对照组具有显著性差异(OR= 4.76 [2.98-7.61]; OR= 11.56 [5.51-24.25]; OR= 4.47 [2.09-9.58]).对既往病史进行单因素Logistic回归分析后发现,流行性腮腺炎病史、阳性家族史和盆腔手术史,包括卵巢囊肿剥除术(子宫内膜异位囊肿、浆液性囊肿和畸胎瘤)、一侧卵巢切除术和输卵管异位妊娠手术(输卵管开窗术、输卵管端端吻合术和输卵管切除术)可显著增加POF的患病风险(OR=3.26 [2.38-4.47]; OR= 28.12 [8.84-89.46]; OR= 5.53 [2.15-14.23])。日常生活中经常饮茶、喜好素食和饮用矿物质水的女性患POF的风险较低(OR= 0.04 [0.03-0.07]; OR= 0.27 [0.19-0.37]; OR= 0.63 [0.47-0.85])。结论：遗传因素、盆腔手术史、流行性腮腺炎病史和有毒物质接触史为POF的危险因素,而多食用素食、饮用矿物质水和茶叶为保护性因素。我们建议有POF易感风险的女性及早进行遗传咨询,远离可引起内分泌紊乱的危险因素,适量进食富含类黄酮的食物,如水果、蔬菜和茶叶等。第二部分肿瘤抑制因子WT1基因变异在卵巢早衰发病机制中的作用研究背景：卵巢早衰(POF)是具有遗传异质性的内分泌疾病,目前已明确遗传因素是POF的一个重要病因,但是大部分患者的病因尚不清楚。WT1基因(Wilms' tumors gene, WT1)是调控哺乳动物尿生殖嵴发育的重要转录因子。在大鼠卵巢颗粒细胞中,WT1的表达量随卵泡的发育而逐渐减少,推测WT1基因可能通过抑制颗粒细胞分化调控卵泡发育。条件性敲除小鼠Wt1+/R394W由于卵泡发育障碍而表现为不孕不育,其表型与POF的临床表现相似。以上发现提示WT1基因可能通过影响颗粒细胞发育而在卵泡发生(folliculogenesis)中起着重要的作用,因而可视作POF的重要候选基因。研究目的：本研究通过对384例中国汉族POF患者的WT1基因编码区进行测序分析,发现基因变异,并就新发变异进行功能预测和体外功能实验,以探讨WT1基因变异在POF发病机制中的作用。研究方法：共纳入2003年4月～2011年12月于山东大学附属生殖医院就诊的384例中国汉族POF患者为研究对象,募集查体中心卵巢功能正常的384例健康女性作为对照。采用直接测序技术对WT1基因编码区进行突变筛查,应用在线软件Mutation Taster Polyphen-2和SIFT对新发错义突变进行功能预测。通过序列比对,在小鼠野生型Wtl表达载体上进行定点诱变,将野生型和突变型Wt1表达载体均进行腺病毒包装、扩增和纯化。野生型和突变型Wt1腺病毒分组感染3周龄小鼠的黄素化颗粒细胞,使Wtl基因过表达,通过实时定量PCR检测Wtl下游基因Amh、Fshr、Lhr、Cyp19、Cdh1和Par6b的表达量,以明确WT1基因新发突变对其转录调控功能的影响。结果：通过对384例POF患者WT1基因编码区进行测序分析发现6个新发突变和10个已知单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。新发突变包括2个错义突变(位于第1外显子的c.376CT, p. Pro126Ser和位于第7外显子的C.1109GA, p. Arg370His)和4个位于内含子区的突变(分别为位于第1内含子的c.647-26CT, c.647-13GC,c.647-13GA和位于第4内含子的c.950+14TC)。10个已知SNPs有8个位于内含子区(rs2234585、 rs1799933、rs5030170、rs5030171、rs2295081、rs5030277、rsl92734605和rs1799937),2个位于编码区但没有改变编码氨基酸(c.330TC,rs1799925和C.1107GA, rs16754)。通过功能预测提示p. Pro126Ser和p. Arg370His可能影响蛋白功能,具有致病性。进一步体外功能实验发现Wt1基因上调下游基因Amh、Cdh1和Par6b的表达,而下调Fshr、Lhr和Cyp19基因的表达。错义突变p. Pro126Ser和p. Arg370His均可抑制下游基因Amh和Cdhl的表达,促进Fshr和Cyp19的表达(P0.05)。结论：受WT1基因转录调控的下游基因AMH, FSHR和CYP19参与颗粒细胞分化,CDH1影响卵母细胞-颗粒细胞相互作用。在中国汉族POF患者中发现的两个新发错义突变p. Pro126Ser和p. Arg370His均影响WT1对以上基因的转录调控作用,导致颗粒细胞分化和卵母细胞-颗粒细胞相互作用障碍,继而引起卵泡的过早耗竭。推测WT1可能是POF的潜在致病基因。第三部分减数分裂重组因子DMC1基因与卵巢早-衰发病机制的相关性研究背景：DMC1基因(DNA meiotic recombinase 1, DMC1)是减数分裂特异性基因,在减数分裂同源重组过程中起着重要作用。DMC1参与联会复合体的形成和双链DNA断裂的修复。Dmcl敲除小鼠的卵母细胞无法形成联会复合体,停滞于减数分裂I期,卵泡数目急剧减少,类似人非综合征型POF的临床表现,提示DMC1基因可作为POF的候选基因。研究目的：本研究对192例中国汉族POF患者进行基因测序分析,探讨DMC1基因与POF发病机制的相关性。研究方法：共纳入192例就诊于山东大学附属生殖医院的中国汉族POF患者。采用直接测序技术对DMC1基因外显子区进行基因突变筛查。将单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的基因型频率和等位基因频率同国际人类基因组单体型图计划数据库公布的亚洲正常人群数据相比较,研究SNPs与中国汉族POF发病的相关性。结果：共发现2个已知SNPs,分别是位于第4内含子的rs11570392和位于第10内含子的rs4987164。这两个SNPs的基因型和等位基因频率在中国汉族POF患者和亚洲正常人群中均无显著性差异(P0.05)。结论：在中国汉族POF人群中,DMC1基因编码区变异并不常见。DMCl基因与POF发病机制的相关性有待在大样本不同种族的POF患者中做进一步研究。第四部分脱氢表雄酮改善卵巢反应不良患者辅助生殖周期中的卵巢反应性及妊娠结局背景：人类辅助生殖(assisted reproduction technique, ART)周期的妊娠率和活产率与卵巢储备密切相关,获卵数和卵子质量是影响妊娠结局的关键因素。卵巢反应不良(poor ovarian response, POR)患者较卵巢功能正常女性在ART周期中获卵数和优质胚胎数均有所减少,导致妊娠率降低。雄激素参与卵泡发育成熟过程,雄激素过低是影响卵子质量的重要因素之一。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)主要来源于肾上腺皮质,是类固醇激素合成的重要前体物质,随着年龄的增加而逐渐减少,在女性生殖周期中起着重要作用。近年来,DHEA已经用于POR患者超促排卵前的预处理,但尚缺乏大样本的研究和长期随访数据。研究目的：探讨DHEA对中国汉族POR患者在ART周期中的卵巢反应性及妊娠结局的影响。研究方法：回顾性分析2012年1月～2014年12月在山东大学附属生殖医院接受体外受精-移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)和胞浆内单精子注射-移植(intra cytoplasmic sperm injection and embryo transfer, ICIS-ET)的POR患者170例。患者服用DHEA 25mg, bid,服药2-4个月后再次IVF/ICSI-ET助孕,前后两周期给予同一控制性超促排卵方案,对患者ART周期中卵巢反应性相关指标和妊娠结局进行自身对照研究。采用配对t检验、非参数检验和卡方检验对患者服药前后卵巢基础窦卵泡数(antral follicle count. AFC)、HCG日优势卵泡数(直径14mm)、血清E2、P和LH水平、获卵数、2PN数、优质胚胎数、妊娠率及流产率进行比较。结果：170例患者平均年龄36岁,其中原发性不孕85例,继发性不孕85例,睾酮均25ng/dl。服用DHEA后HCG日14mm以上上卵泡数、获卵数、2PN卵数和优质胚数[5.59+4.09,6.42+5.33,3(1-5),1(0-3)]较服药前[4.87+3.15,5.74+4.29,2(1-4),0(0-2)]均有显著改善,具有统计学意义(P0.05)。经卡方检验发现治疗后临床妊娠率[29(17.06%)]显著高于治疗前[1(0.59%)],生化妊娠流产率[6(3.53%)]显著低于治疗前[12(7.06%)](P0.01)。基础窦卵泡数和HCG日血清E2、P和LH水平服用DHEA前后无显著性差异(P0.05)。结论：DHEA预处理可以增加POR患者获卵数,改善卵子及胚胎质量,提高临床妊娠率,降低生化妊娠流产率。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.75

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