孕早期胚胎（胎儿）停止发育的分子遗传学研究
发布时间：2020-08-13 13:59
【摘要】：研究背景:染色体异常是引起稽留流产(Missed abortion,MA)的主要原因。随着基因组学的发展及检测方法的进步,深入探寻MA遗传学层面的发病机制逐渐成为当前的研究方向。本研究采用全外显子测序(Whole-exome sequencing,WES)技术对染色体检测正常的稽留流产保存的妊娠组织(the retained products of conception,POC)进行检测,通过生物信息学分析寻找WES结果中早期胚胎(胎儿)发育停滞或死亡相关的重要基因,有助于为研究MA的发生机制提供新思路。国内外在POC中通过WES分析研究MA相关基因的报道很少。本实验研究分两部分完成。一、传统染色体核型分析及高通量测序检测稽留流产绒毛组织目的:比较传统染色体核型分析与基于高通量测序(next generation sequencing,NGS)的染色体组拷贝数分析(copy number variation analysis,CNVA)对稽留流产POC的检测结果,探讨两种方法诊断POC染色体的一致性以及各自的优势和局限性。方法:收集69例稽留流产POC,分别用传统染色体核型分析与NGS检测其染色体,分析两种方法得到的结果。结果:①传统染色体核型分析较NGS-CNVA诊断成功率低(p0.05)。②传统染色体核型分析法在所有样本中的染色体异常检出率显著低于NGS方法(p0.05)。③两种方法均发现MA标本中以染色体数目异常为最常见类型,其中又以常染色体异常多见。④两种方法检测结果相符率高达93.33%。⑤两种方法检测染色体正常的有12例。结论:传统染色体核型分析和NGS两种方法检测POC染色体各有优缺点,检测结果一致性较高,有效结合可以更好地提高诊断效能。二、对染色体正常的稽留流产标本行全外显子测序及生物信息分析目的:对染色体正常的不明原因稽留流产POC行WES,查找MA的遗传学病因,发现导致早期胚胎(胎儿)死亡的重要基因及变异。方法:①对染色体正常的不明原因流产绒毛组织标本提取的DNA行WES。②通过小鼠基因组数据库(Mouse Genome Informatics,MGI)找到在以往小鼠遗传学研究中存在胚胎发育异常、胚胎致死或胚胎发育停滞的基因。③对WES数据筛选、分析及验证。结果:①第一部分染色体正常的12例标本因待检DNA降解严重无法进一步检测。②对染色体正常的19份新鲜标本行WES,并进行数据筛选、分析及验证结果。③通过生物信息学分析工具分析,筛选出36个罕见突变,涉及32个基因。④LDB1杂合突变c.662CT变异通过多种预测工具分析为致病等位基因,变异极为罕见,被预测为与胚胎死亡有关高致病性变异,POC中的LDB1突变与MA发生可能有关。⑤发现DIDO1、LIAS、ATE1、OTX2、NF1、PTCH1、TRIM28、GAS1、INTS1、SRRT 和 CREBBP 也是可能导致MA的候选基因。结论:WES技术结合生物信息分析技术用于染色体正常的稽留流产POC检测与分析,可以得到胚胎的全外显子组信息,发现可能引起孕早期胚胎(胎儿)死亡的基因突变。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.5
【图文】：
２．９．２各染色体中心粒或端粒位置用黑色的点表示。逡逑２．９．３纵坐标轴为拷贝数，正常人胚胎是二倍体，常染色体拷贝数应为２；性染色体：逡逑Ｘ两个拷贝（女性），或Ｘ、Ｙ各一个拷贝（男性）。如图１所示为染色体为４６，ＸＸ、逡逑１５逡逑
解放军医学院博士学位论文基因本体（Ｇｅｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＧＯ）分析，我们发现这３２个基发育等生物学过程中，例如脊索动物胚胎发育、细胞增殖以。其中邋７邋个基因（兄４７Ｚ４，逦＆４ＬＫ，／／５Ｆ７，邋／ＡＴＷ，b6ｒＣ／Ｗ物胚胎发育生物过程中，５个基因（ＸＤＭＬ４，邋ｉＶＯｒＣｆｆｌ，邋７ＶＦ／，邋ＯＬ发育过程中。这１２个基因均有文献证实任何一个被敲除后将死亡。逡逑３２个ＭＡ关联基因的基因注释（ＧＯ）分析逡逑＿逦＊逡逑
通过ＰＣＲ扩增ＬＤ５７基因突变两侧区域约５００－６００邋ｂｐ，ＰＣＲ产物交由测序公司逡逑进行Ｓａｎｇｅｉ？测序反应，之后我们通过分析测序结果发现在基因编码区第６６２逡逑位确实存在Ｃ突变为Ｔ的杂合变异（图３）。因此验证结果与全外显子组测序结果逡逑相符。逡逑ＬＤＢ１，逡逑ｃ．６６２Ｃ＞Ｔ逡逑１逡逑Ｇ邋Ａ邋ＧＣＴ邋ＣＡＴ邋Ｇ邋Ｔ邋Ｔ邋－邋Ｃ邋６邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ．邋Ｇ逡逑图３邋Ｓａｎｇｅｒ测序验证了逦基因编码区第６６２位确实存在Ｃ突变为Ｔ的杂合变异逡逑四、讨论逡逑本研究旨在发现导致早期胚胎（胎儿）死亡的重要基因及变异。近日有研究发逡逑现１０３个产前致死有关的基因，发现其中约６８％的基因突变都会导致胎盘畸形，而逡逑早期胚胎死亡几乎都与严重的脑、心脏和血管的发育异常等胚胎畸形有关［７４］。已有逡逑大量动物实验证明，与胚胎期心脏及血管等发育相关的基因，如八逡逑Ｇｒｋ２、Ｈｏｐｘ、ｈｌｌ、Ｌｄｂｌ、Ｍａｐｋ７、Ｓｌｃ８ａｌ、Ｓｒｆ、Ｔｂｘ２０邋等，敲
本文编号：2792095
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R714.5
【图文】：
２．９．２各染色体中心粒或端粒位置用黑色的点表示。逡逑２．９．３纵坐标轴为拷贝数，正常人胚胎是二倍体，常染色体拷贝数应为２；性染色体：逡逑Ｘ两个拷贝（女性），或Ｘ、Ｙ各一个拷贝（男性）。如图１所示为染色体为４６，ＸＸ、逡逑１５逡逑
解放军医学院博士学位论文基因本体（Ｇｅｎｅ邋Ｏｎｔｏｌｏｇｙ，ＧＯ）分析，我们发现这３２个基发育等生物学过程中，例如脊索动物胚胎发育、细胞增殖以。其中邋７邋个基因（兄４７Ｚ４，逦＆４ＬＫ，／／５Ｆ７，邋／ＡＴＷ，b6ｒＣ／Ｗ物胚胎发育生物过程中，５个基因（ＸＤＭＬ４，邋ｉＶＯｒＣｆｆｌ，邋７ＶＦ／，邋ＯＬ发育过程中。这１２个基因均有文献证实任何一个被敲除后将死亡。逡逑３２个ＭＡ关联基因的基因注释（ＧＯ）分析逡逑＿逦＊逡逑
通过ＰＣＲ扩增ＬＤ５７基因突变两侧区域约５００－６００邋ｂｐ，ＰＣＲ产物交由测序公司逡逑进行Ｓａｎｇｅｉ？测序反应，之后我们通过分析测序结果发现在基因编码区第６６２逡逑位确实存在Ｃ突变为Ｔ的杂合变异（图３）。因此验证结果与全外显子组测序结果逡逑相符。逡逑ＬＤＢ１，逡逑ｃ．６６２Ｃ＞Ｔ逡逑１逡逑Ｇ邋Ａ邋ＧＣＴ邋ＣＡＴ邋Ｇ邋Ｔ邋Ｔ邋－邋Ｃ邋６邋Ｃ邋Ｃ邋Ａ邋Ｃ邋Ａ邋Ａ．邋Ｇ逡逑图３邋Ｓａｎｇｅｒ测序验证了逦基因编码区第６６２位确实存在Ｃ突变为Ｔ的杂合变异逡逑四、讨论逡逑本研究旨在发现导致早期胚胎（胎儿）死亡的重要基因及变异。近日有研究发逡逑现１０３个产前致死有关的基因，发现其中约６８％的基因突变都会导致胎盘畸形，而逡逑早期胚胎死亡几乎都与严重的脑、心脏和血管的发育异常等胚胎畸形有关［７４］。已有逡逑大量动物实验证明，与胚胎期心脏及血管等发育相关的基因，如八逡逑Ｇｒｋ２、Ｈｏｐｘ、ｈｌｌ、Ｌｄｂｌ、Ｍａｐｋ７、Ｓｌｃ８ａｌ、Ｓｒｆ、Ｔｂｘ２０邋等，敲
本文编号：2792095
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