去泛素化酶USP6通过调节c-Jun蛋白水平增强Hela细胞的侵袭能力

发布时间：2020-08-14 08:12

【摘要】：目的c-Jun是转录因子复合物AP-1(activator protein 1,AP-1)的重要组成部分,在调控肿瘤的分化发育以及诱导机体产生炎症反应的过程中起重要作用。研究表明细胞内c-Jun蛋白很不稳定,极易发生泛素化/蛋白酶依赖的蛋白降解。目前已发现了多个c-Jun蛋白的泛素连接酶,这些泛素连接酶通过泛素化c-Jun蛋白,下调了c-Jun的蛋白水平,从而调控c-Jun介导的细胞信号通路。然而与泛素连接酶相对应的去泛素化酶在调控c-Jun蛋白及其功能的研究鲜有报道。为了回答这一科学问题,本研究将通过构建去泛素化酶基因表达库,并利用该表达库筛选调控c-Jun蛋白水平的去泛素化酶,初步探讨所筛选的的去泛素化酶对c-Jun下游信号通路及其c-Jun依赖的肿瘤细胞侵袭行为的影响。方法(1)利用分子克隆技术构建去泛素化酶基因表达库,运用磷酸钙转染将去泛素化酶基因表达库中的所有质粒分别转染到293T细胞,转染48h后裂解细胞提取蛋白,通过Western Blot技术检测去泛素化酶表达水平。(2)运用脂质体转染技术将去泛素化酶基因表达库中的所有质粒分别转染到Hela细胞,转染48h后裂解细胞提取蛋白,通过Western Blot技术检测转染前后c-Jun蛋白的表达水平。(3)利用免疫共沉淀实验法进行体外去泛素化测定,检测USP6是否可在体外直接去泛素化c-Jun。(4)构建c-Jun敲低的稳定细胞系,运用AP-1报告基因荧光素酶活性检测分析敲低c-Jun对USP6诱导AP-1转录活性的影响。(5)运用Realtime-PCR检测MMP10基因的表达水平,分析USP6对c-Jun下游基因MMP10的调节作用。(6)利用Transwell法检测USP6对细胞侵袭能力的影响。结果(1)初步构建了去泛素化酶基因(共68个)表达库,利用去泛素化酶表达库筛选发现USP6可调节c-Jun蛋白的水平。(2)在体外泛素化实验中,野生型USP6能直接去泛素化c-Jun,而酶活性突变体USP6不能直接将c-Jun去泛素化。(3)敲低c-Jun可下调USP6对AP-1启动子荧光素酶报告基因活性的影响。(4)敲低USP6后可下调Hela细胞MMP10基因的表达,并且敲低c-Jun后可阻断USP6对MMP10表达的诱导作用。(5)过表达USP6能显著增强Hela细胞的侵袭能力,敲低USP6能抑制Hela细胞的侵袭能力;敲减c-Jun后过表达USP6不能增强Hela细胞的侵袭能力。结论去泛素化酶USP6通过去泛素化作用,稳定c-Jun蛋白水平,提高AP-1活性,促进MMP10的转录,增强Hela细胞的侵袭能力。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.33
【图文】：

方法,载体,图谱

图 2.4.2 USP6突变体构建方法2.2.1.3 USP6、c-Jun RNA干扰质粒的构建本实验所使用的干扰载体为 pLV-H1-EF1a-puro，载体图谱如下图所示

泛素化,质粒,WesternBlot检测,转染

素化基因表达库：将所有的去泛素化酶表达质粒，利用磷酸钙48h收集细胞总蛋白，Western Blot检测去泛素化酶的表达情素化酶表达库筛选发现 USP6 调节 c-Jun 蛋白有调节 c-Jun蛋白水平的相关的去泛素化酶，我们对建立达库进行了筛选。我们将所有的去泛素化酶表达质粒利胞，48h 后提取细胞总蛋白，利用 Western -Blot 检测 c- USP6质粒的 Hela 细胞，c-Jun 的蛋白表达水平增高，见

泛素化,质粒,后提取,脂质体转染

立去泛素化基因表达库：将所有的去泛素化酶表达质粒，利用磷酸钙转3T细胞，48h收集细胞总蛋白，Western Blot检测去泛素化酶的表达情况。用去泛素化酶表达库筛选发现 USP6 调节 c-Jun 蛋白水筛选具有调节 c-Jun蛋白水平的相关的去泛素化酶，我们对建立的基因表达库进行了筛选。我们将所有的去泛素化酶表达质粒利用脂 Hela 细胞，48h 后提取细胞总蛋白，利用 Western -Blot 检测 c-Jun。转染 USP6质粒的 Hela 细胞，c-Jun 的蛋白表达水平增高，见图

【参考文献】