多组学用于卵巢癌发展、凋亡、调控、新分类方式探索及相关靶点及信号通路研究

发布时间：2020-08-21 18:11

【摘要】：研究目的:本课题利用采用小分子药物、非编码RNA序列及多组学方法,探索卵巢癌发展的相关调控因素,并根据TCGA数据库的信息,对浆液性卵巢癌进行多组学分析,探索卵巢癌的调控机制、凋亡相关因素其核心目的是找到一种新的诊断和治疗方法,可以优化卵巢癌,这对更多的卵巢癌患者有益。研究方法①使用Arctigenin对上皮卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3进行抑制实验。用Ac-DEVD-CHO预处理卵巢癌细胞抑制了 caspase-3活性。转染空载体或pcDNA3.1-Survivin的质粒。使用Arctigenin直接干预所研究的细胞并使用稳定而可靠的细胞凋亡检测试剂盒分析细胞凋亡。Western blotting和ECL化学发光检测系统检测免疫反应性复合物的结合;②利用成熟的实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)用于检测卵巢癌组织样本中DARS-AS1的表达的程度。检测DARS-AS1对卵巢癌增殖和转移的影响,通过荧光素酶测定和RNA免疫沉淀(RIP)对潜在机制进行探索;③根据公共数据库的599例浆液性卵巢癌患者的1203个样品的DNA甲基化、蛋白质、microRNA和基因表达情况采用无监督分类算法进行分类,依据RNA-seq数据分成9个亚型,再将亚型与预后以及临床因素之间进行关联评估,并对基于不同组学数据整合的亚型进行关联性评估。研究结果①基础状态时卵巢癌细胞存在iNOS高表达。与对照组相比,Arctigenin治疗组中iNOS的表达水平比基线低2至4倍。与化学NO供体共孵育时,由Arctigenin诱导的STAT3磷酸化和Survivin表达受抑现象被逆转;外源性NO的加入可拮抗牛蒡子素诱导的卵巢癌细胞凋亡。②DARS-AS1在卵巢癌组织中的表达显着高于癌旁组织。当DARS-AS1在卵巢癌细胞中沉默时,细胞增殖受到抑制,细胞迁移和侵袭能力也受到抑制。microRNA-532-3p是DARS-AS1在卵巢癌中的直接靶标。敲除DARS-AS1后,miR-532-3p表达上调。③(1)基于RNA-seq结果将SOC分为九个亚型,相关基因主要在以下四个生物学行为过程中聚集:免疫活性、激素代谢、间充质发育和MAPK信号传导过程中(2)基于DNA甲基化、蛋白质和microRNA表达水平的结果根据甲基化差异分成四种亚型,根据蛋白质阵列分成两个聚类的NMF模型;根据microRNA表达水平发现六组高表达microRNA。(3)基于综合通路确定了四个聚类的PAM模型。结果表明基于一个组学的数据集的亚型无法完全替代其他组学的数据。结论①Arctigenin可抑制卵巢癌细胞增殖。其作用机制是该药物通过STAT3/Survivin信号系统诱导卵巢癌细胞中caspase-3依赖性细胞凋亡;②DARS-AS1通过捕捉卵巢癌miR-532-3p增强细胞增殖和转移;③多组学的研究结果表明:基于一个组学的数据集的亚型无法完全替代其他组学的数据。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
【图文】：

为了验证Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ诱导的０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３细胞增殖抑制是否因凋亡逡逑诱导所致，所以使用ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ结合试验用于评估用Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ处理的卵巢逡逑癌细胞０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３的细胞凋亡。如图２邋Ａ所示，０ＶＣＡＲ３细胞添加逡逑Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ后，使ａｎｎｅｘｉｎ－邋Ｖ＋凋亡百分比增加４倍，ＳＫ０Ｖ３细胞凋亡百分逡逑比增加６倍（相对于未处理的对照组，ｐ［０．邋０５）。邋Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析的结果进逡逑—步证实了与未处理对照相比给予Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ。邋卵巢癌０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３逡逑细胞中ｃａｓｐａｓｅ－３裂解显著增加（图２邋Ｂ）。逦为了证明ｃａｓｔｉａｓｅ－３激活参与逡逑牛蒡子素诱导的细胞凋亡，采用Ａｃ－邋ＤＥＶＤ－邋ＣＨ０对卵巢癌０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３细逡逑胞进行２小时的预处理，然后给予Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ。最终成效非常明显，用Ａｃ－逡逑ＤＥＶＤ－ＣＨ０预处理的卵巢癌０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３细胞系，其Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ诱导的逡逑细胞凋亡过程均被阻断（图２邋Ｃ）。逡逑－６０－逡逑

为了确定Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ对ＳＴＡＴ３激活的影响作用，我们使用蛋白质印迹分析逡逑检测了邋ＳＴＡＴ３的枺酸化水平。结果显示，与未给予Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ的对照组相比，逡逑Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ抑制残基Ｙ７０５处ＳＴＡＴ３的枺酸化（图３Ａ）。给予Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ处理逡逑后，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的蛋白浓度持续降低（图３Ｂ）。随后，我们检测了邋ＳＴＡＴ３／Ｓｕｒｖｉｖｉｎ逡逑信号传导系统的失活是否因Ａｉｘｔ邋ｉｇｅｎｉｎ诱导的０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３细胞凋亡所致。逡逑如图３Ｃ所示，使用表达Ｓｕｒｖｉｖｉｎ质粒进行预转染明显（ｐ邋＜０．０５）阻断了给予逡逑Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ后引起的卵巢癌０ＶＣＡＲ３和ＳＫ０Ｖ３细胞的凋亡过程。逡逑Ａ逦ＯＶＣＡＲ３逦ＳＫＯＶ３逦＾逦１逦＿0ＶＣＡＲ３逡逑…邋＂邋丨．；逦ｒ—邋逦邋卜逦，逦Ｏ邋ＳＫＷ３逡逑ＣｗＷ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｒｒｎｇｍｍ邋＜逦ｆ邋！逡逑，ｓｗａｃ＾ｎ［＾ｒ｜逦Ｉ逦１＇逦■邋■逡逑逦逦邋＾邋°－ｓ，邋Ｉ邋．逦！邋＊逡逑ＳＴＡＴ３邋ｍｍｍ邋ｍｗｍ邋ｍｍｍｍ邋ｍｕｍ逦ｍ逦ｆ逦ｍＩＭ邋１逡逑逦逦ｔ逦逦逦邋众邋ｑ邋ｉ－ｊｍ—．．．：，．、ｕｒｍ一．＿＊逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ逡逑Ｂ逦0

本文编号：2799695