ACTN4调控滋养细胞增殖和侵袭能力在早发型子痫前期发病中的作用研究

发布时间：2020-08-22 01:36

【摘要】：研究背景:早发型子痫前期(EO-PE)是发病于34周之前的一种妊娠特有的并发症,其发病原因众多,目前公认的滋养细胞侵袭力不足是其主要原因之一。细胞侵袭依赖于细胞骨架重塑和侵袭结构的形成,ACTN4作为肌动蛋白主要维持细胞骨架的完整性和调节细胞的运动。本课题旨在研究ACTN4在EO-PE胎盘滋养细胞中的表达,研究并探讨ACTN4表达异常对滋养细胞功能的影响,并探索其调控机制,以期为阐明子痫前期发病机制提供新的研究方向,并为子痫前期的预测和治疗提供潜在的靶点。方法:利用免疫组化法和Western blot法检测ACTN4在正常胎盘组织和EO-PE胎盘组织中的表达和定位,并分离原代滋养细胞,检测其在原代滋养细胞中的表达。然后用siRNA干扰方法对ACTN4进行敲降,并用CCK-8法、流式细胞周期和EdU法检测敲降细胞的增殖能力。用Western blot法检测敲降ACTN4后对AKT/GSK3β通路的影响。利用Co-IP法和胞质、胞膜分离法检测ACTN4对AKT膜转移及其活化的作用。用免疫荧光法和Co-IP法检测E-cadherin敲降细胞中ACTN4和β-catenin的定位和互作情况。用TRITC-phalloidin法检测敲降E-cadherin和(或)敲降ACTN4的JEG3细胞骨架的改变。并用Matrigel侵袭和Transwell迁移法检测各组细胞的侵袭和迁移能力。最后,通过尾静脉注射ACTN4干扰腺病毒构建ACTN4敲降孕鼠模型,测量孕鼠血压和胎盘、胎鼠重量情况,和胎盘、肾脏组织病理结构的变化及胎盘组织中ACTN4和AKT通路蛋白的表达情况。结果:免疫组化法和Western blot法结果显示,与正常胎盘滋养细胞相比,ACTN4在EO-PE胎盘滋养细胞中异常低表达。CCK-8法、流式细胞周期法和EdU法结果均显示敲降ACTN4显著降低HTR8/SVneo细胞的增殖能力,且Western blot法结果显示敲降ACTN4明显抑制AKT/GSK3β通路的活性。Co-IP法和胞质、胞膜分离法结果显示ACTN4和AKT之间存在相互作用,且ACTN4对于AKT膜转移并活化至关重要。另外,免疫荧光法、Co-IP法和Western blot法结果显示,E-cadherin敲降的JEG3细胞中,ACTN4和β-catenin相互作用关系明显增强,且这种增强主要表达定位于细胞伪足。TRITC-phalloidin法和侵袭迁移法结果显示,E-cadherin敲降的JEG3细胞骨架高度重塑且侵袭迁移能力明显增强,而在这基础之上再下调ACTN4的表达时,细胞骨架出现解聚,侵袭迁移能力随之明显减弱。最后,注射ACTN4干扰腺病毒的孕鼠,血压出现明显升高,胎盘和胎鼠重量出现明显下降,胎盘连接层面积和增殖细胞均出现明显减少,肾脏肾小球出现明显肿胀,胎盘ACTN4和AKT通路蛋白活性均明显下降。结论:ACTN4主要表达于胎盘的CTB细胞和iEVT细胞,且在EO-PE胎盘滋养细胞中的表达较正常组明显降低。ACTN4通过调控AKT的膜转位及活性进而调控滋养细胞的增殖能力,且ACTN4-β-catenin作为细胞骨架及细胞伪足形成的关键,参与滋养细胞侵袭和迁移能力,受E-cadherin负性调节。ACTN4敲降孕鼠出现胎盘化异常和PE样表型改变。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.244
【图文】：

免疫组化法,绒毛,胎盘,蛋白表达

23图 1. ACTN4 在胎盘组织中的表达模式Figure 1. ACTN4 expression pattern in placentaA, 免疫组化法检测 ACTN4 在早孕组织中的表达模式。a, b, d, e 为绒毛组织，c, f 为蜕膜组织，AV, 锚定绒毛；FV，漂浮绒毛；CCT，细胞柱滋养细胞；STB，合体滋养细胞；CTB，细胞滋养层细胞；iEVT, 间质绒毛外滋养细胞。B，免疫组化法检测 ACTN4 在晚孕正常胎盘（a, c, e, g）和 EO-PE 胎盘（b, d, f, h）组织中的表达模式。BP, 胎盘基底面；DS，蜕膜面。C，Western blot 法检测 ACTN4 在早孕绒毛组织和正常足月胎盘组织中的蛋白表达。β-actin 作为内参；NS，无显著差异。D，Western blot 法检测 ACTN4 在正常胎盘组织和 EO-PE 胎盘组织中的蛋白表达。*P < 0.05，数据以平均值±标准误表示。

滋养细胞,免疫荧光法,骨架,蛋白表达

图 2. 正常原代滋养细胞和 EO-PE 原代滋养细胞 ACTN4 的蛋白表达和骨架改变Figure 2. ACTN4 expression and actin filaments in normal CTBs and EO-PE CTBsA，免疫荧光法鉴定原代 CTB 细胞的纯度。DAPI，染核。B，Western blot 法检测 ACTN4在正常原代 CTB 细胞（N-CTB）和 EO-PE 原代 CTB 细胞（EO-PE-CTB）中的表达，β-actin作为蛋白内参，**P < 0.01，数据以平均值±标准误表示。C，TRITC-phalloidin 检测滋养细胞骨架（actin-filament, F-actin）的改变。A, IF staining of CK7 (green) and vimentin (red) in isolated cells from human term placentas.Nuclei were counterstained by DAPI (blue). B, Western blotting of ACTN4 in primary CTB cellsisolated from normal and EO-PE placentas. Data are presented as the means±SEM. **P < 0.01. C,TRITC-Phalloidin staining on primary CTBs isolated from normal (N-CTB) and early-onset PE(EO-PE-CTB) placentas. All data are of 3 independent experiments performed in triplicate.3 讨论早期胎盘的发育及滋养细胞的分化是成功妊娠的关键[6]。CTB 细胞分化异常影响了滋养细胞对子宫的侵袭，从而导致螺旋动脉重构异常和胎盘灌注不足[7,8]。

蛋白表达,干扰效率,周期法,标准误

图 1. ACTN4 调节 HTR8/SVneo 细胞增殖能力Figure 1. ACTN4 regulates trophoblast proliferationA，Western blot 法检测 ACTN4 在 HTR8/SVneo、JEG3 和 JAR 细胞中的蛋白表达。B，Western blotting 法检测 ACTN4 的干扰效率。C，CCK-8 法检测 ACTN4 敲降 0 h，24 h，48 h，72 h 后细胞的增殖能力。D，流式细胞周期法检测敲降 ACTN4 48 h 后细胞周期的分布。E，EdU 法检测敲降 48 h 后细胞的 DNA 合成能力。NC，无显著差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P< 0.001，数据以平均值±标准误表示。A, Western blotting of ACTN4 in HTR-8/SVneo, JAR, and JEG3 cells. B, Interferenceefficiency of siRNAs targeting ACTN4 in HTR-8/SVneo cells was assessed by Western blotting. NC,negative control. C, CCK-8 assay on HTR-8/SVneo cells after 0, 24, 48, and 72 h of si-ACTN4#1and si-ACTN4#2 transfection. D, Cell cycle analysis of HTR-8/SVneo cells by flow cytometry after48 h of si-ACTN4#1 and si-ACTN4#2 transfection. E, EdU (pink) staining on HTR-8/SVneo cellsafter 48 h of si-ACTN4#1 and si-ACTN4#2 transfection. Nuclei were counterstained with DAPI(blue). Scale bars, 200 mm. All data are means ± SEM of 3 independent experiments performed intriplicate. NS, nonsignificant. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

【相似文献】