Bcl-2抑制剂ABT737通过糖代谢重编程增加氧化应激诱导的卵巢癌细胞凋亡机制的研究

发布时间：2020-08-25 05:26

【摘要】：诱导肿瘤细胞氧化应激是一些化疗药物的主要抗肿瘤机制之一,活性氧(ROS)对维持细胞氧化还原平衡起着至关重要的作用,可以诱导细胞的凋亡。人们期待着通过各种方法增加氧化应激以达到最大的抗肿瘤效果。另外,人们发现即使氧充足,肿瘤细胞依然主要通过糖酵解进行葡萄糖代谢,这有利于肿瘤细胞的快速增殖,人们将这种糖代谢的重编程称为“Warburg效应”。线粒体是氧化还原平衡、细胞凋亡的调控、细胞糖代谢及信号转导的交汇点,以往实验研究表明,线粒体抗凋亡蛋白Bcl-2可能与抗氧化作用有关,而最近的研究表明,Bcl-2家族蛋白不仅与凋亡相关,还参与了细胞代谢的调控。因此,提示我们探讨抗凋亡Bcl-2蛋白与细胞糖代谢、氧化应激的关系,可能为阐明以诱导氧化应激为目标的抗肿瘤机制提供新的线索。本研究以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,探究Bcl-2抑制剂ABT737对肿瘤细胞糖代谢重编程的调控作用以及整合氧化应激与糖代谢重编程增加细胞凋亡的机制,为以氧化应激为靶点治疗肿瘤提供新的思路。实验方法:1)MTT法检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加对SKOV3细胞存活率的影响。2)流式细胞术检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加对SKOV3细胞凋亡的影响,Western Blot检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加对SKOV3细胞凋亡蛋白表达的影响。3)使用100μM和300μM两种浓度的H_2O_2处理SKOV3细胞,流式细胞术、荧光显微镜检测细胞ROS水平、线粒体膜电势、线粒体ROS水平。4)流式细胞术检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加后细胞ROS水平,使用SOD试剂盒检测SOD活力。5)流式细胞术检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加后细胞线粒体膜电势和线粒体ROS水平。6)Western Blot检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加对细胞Sirt3、HIF-1α以及一些糖代谢相关蛋白表达的影响。7)使用葡萄糖摄取、乳酸生成试剂盒检测单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加后细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成。实验结果:1)H_2O_2和ABT737都能够抑制SKOV3细胞的存活率,并且这种抑制作用表现出剂量依赖性,相比于H_2O_2单加组,合加组对SKOV3细胞存活率的抑制作用更加明显。2)H_2O_2和ABT737都能够使细胞凋亡率上升,相比于H_2O_2单加组,合加组凋亡率上升更加明显;H_2O_2和ABT737都能够影响凋亡相关蛋白的表达,使Bax、cleaved-caspase3表达水平上升。3)100μM和300μM两种浓度的H_2O_2均可以使细胞ROS水平升高、线粒体膜电势下降、线粒体ROS水平升高,且效果表现出剂量依赖性,说明H_2O_2复制氧化应激模型成功,并且有可能通过氧化损伤机制来诱导肿瘤细胞凋亡。4)单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加都能够使细胞ROS水平升高,SOD活力下降,相比于H_2O_2单加组,合加效果更加明显,说明H_2O_2和ABT737都能够破坏氧化还原平衡,引起氧化应激。5)单加H_2O_2、单加ABT737以及H_2O_2与ABT737合加都能够使细胞线粒体膜电势下降,线粒体ROS水平升高,相比于H_2O_2单加组,合加膜电势下降更加明显,但与单加H_2O_2相比,合加组线粒体ROS水平几乎无上升,说明H_2O_2和ABT737都能够损伤细胞线粒体。6)单加H_2O_2组Sirt3表达水平下降,HIF-1α表达水平上升,P-PDH/PDH比值降低;单加ABT737组、H_2O_2和ABT737合加组Sirt3表达水平上升,HIF-1α表达水平下降,Glut1、HK2、PKM2、LDHA表达水平均下降,P-PDH/PDH比值降低,说明ABT737有调控糖代谢重编程的作用。7)H_2O_2单加组葡萄糖摄取和乳酸生成略有上升,但无统计学意义;ABT737单加组、H_2O_2和ABT737合加组葡萄糖摄取和乳酸生成都下降,说明ABT737可以抑制肿瘤细胞的糖酵解。实验结论:1)Bcl-2抑制剂ABT737能够调控卵巢癌SKOV3细胞的糖代谢重编程,抑制糖酵解,减少葡萄糖摄取和乳酸生成,增强氧化磷酸化,从而诱导细胞凋亡。2)Bcl-2抑制剂ABT737能够诱导SKOV3细胞产生氧化应激,并且通过对糖代谢重编程的调控作用增强氧化应激诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡。综上,我们推测靶向线粒体的抗肿瘤小分子化合物Bcl-2抑制剂ABT737通过细胞糖代谢途径来增强氧化应激诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的作用,可能是联合其他药物治疗肿瘤的实验基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

重编程,糖代谢,肿瘤细胞,糖酵解

[30]。乳酸生成也可能是肿瘤代谢中的正反馈控制机制。由于乳酸的过度生成，细胞内的 PH 下降，抑制糖酵解中的限速酶 PFK-1，最终的结果又是糖酵解。（3）线粒体功能的损伤。OXPHOS 是线粒体中的主要代谢途径，但也可以产生破坏细胞的活性氧（ROS）和自由基。ROS 的过量产生可能引发大分子和细胞内外信号通路的损伤，可能导致癌症的发展。LopezLázaro 假定肿瘤细胞具有独特的代谢[31]。正常细胞更偏向于用氧和葡萄糖通过 OXPHOS 产生水和二氧化碳，但氧也被转化为 ROS（例如 H2O2和 O2-），从而在肿瘤细胞中诱导糖酵解。此外，H2O2可以增强 Na+/ H+-ATPase 的活性，提高原癌基因的表达。O2-的形成导致癌细胞中的碱化，消耗质子并刺激 PFK-1。线粒体解偶联蛋白 UCP2 已经被证明在几种耐药性肿瘤细胞系中过表达[32]，许多科学家认为肿瘤细胞糖酵解增强是由于这种线粒体解偶联蛋白。有研究显示，UCP2 过表达导致的化疗耐药性显着降低多种抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞凋亡[33]。

家族,蛋白,细胞色素,二聚化

由此引发 RIP1 和 TRADD 从复合体 I 分离。然后 RIP1 和 TRADD 与 FADD和 caspase8、caspase10 结合，形成复合体 II[46, 47]。激活 caspase8、caspase10 之后，死亡信号就会被传递和放大，然后通过直接激活 caspase3、caspase6、caspase7或促进 Bax 和 Bak 与 Bid 结合来激活内源性凋亡途径。当细胞毒性内部刺激产生时，促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 发生结构变化并活化。Bax 和 Bak 转移到线粒体并发生同型二聚化，暴露隐藏的结合位点，并将孔引入线粒体表面。这导致线粒体膜透化（MOMP）增加和蛋白从线粒体膜间隔（IMS）释放[48, 49]。细胞色素 C 是最重要的 IMS 蛋白，它能够引发凋亡体的形成。细胞质的细胞色素 C 在 ATP 或 dATP 存在下与 caspase 衔接分子 Apaf-1 瞬时地结合，诱发 Apaf-1 寡聚化形成轮状七聚体，暴露其 caspase 活化和募集域（CARD）[50]。所以 Apaf-1 的 CARD 结构域与 pro-caspase9 的 CARD 结合形成凋亡体。在这种复合结构中，pro-caspase9 能够发生二聚化并自动激活，活化的 caspase9 随后激活 caspase3 和 caspase7，执行细胞凋亡程序。

家族,蛋白,滤泡性淋巴瘤,人类

3.2.2 细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡作为肿瘤进展调节因子的重要性得到了明确的认可[51]，多种在肿展中有影响的基因的活化可以调节细胞死亡，最明显的是 Bcl-2，fas 和 p53种肿瘤被证明与凋亡抑制相关，包括滤泡性淋巴瘤、具有 p53 突变的肿瘤依赖性肿瘤，比如乳腺癌，前列腺癌和卵巢癌[53, 54]。事实上，p53 肿瘤抑制在大多数人类癌症中失活，来自多种人类恶性肿瘤的细胞具有降低的凋亡能。研究显示肿瘤细胞经历凋亡时抗性增加的分子基础，并且定义了几个在细亡调控中至关重要的基因[56]。Bcl-2 基因位于 14 至 18 号染色体之间的易位存在于大多数人类滤泡性淋巴瘤中[57]。研究证明 Bcl-2 可以控制细胞凋亡阈一系列基因[58]。此外，Bcl-2 家族蛋白中的一种抗凋亡蛋白 Bcl-xl 是 AP-图 1.3 Bcl-2 家族蛋白与细胞凋亡

【参考文献】