羊膜间充质干细胞移植联合雌激素治疗宫腔粘连的动物实验研究

发布时间：2020-08-28 08:57

　　目的:利用机械感染双重损伤法建立大鼠宫腔粘连(IUA)模型,以探讨羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和(或)雌激素在治疗宫腔粘连中的效果及其可能的作用机制。方法:1.采用酶消化法提取hAMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD90、CD34、HLA-DR和免疫荧光检测波形蛋白(VIM)和角蛋白(CK19)的表达以鉴定hAMSCs。采用PKH26对第3代h AMSCs进行荧光染色,计算即时标记率。通过CCK-8实验检测h AMSCs活性和增殖能力,流式检测细胞凋亡和周期,以明确PKH26染色剂对hAMSCs生物学特性的影响。2.选取60只雌性SD大鼠随机分成5组,依次为空白组(A)、模型组(B)、雌激素组(C)、hAMSCs移植组(D)、h AMSCs移植和雌激素联合组(E)。利用机械感染双重损伤法建立大鼠IUA模型,1W后每组分别取6只大鼠子宫进行HE和Masson染色以判断建模是否成功。C、D、E组余下的大鼠给予相应的治疗:C组给予0.1mg/kg口服雌激素,连续5d;D组经尾静脉移植1mL PKH26标记的h AMSCs(约2x10~6个);E组同时给予C和D组的治疗。治疗后2W,收集每组大鼠子宫组织,采用HE染色计算子宫内膜中腺体数目、Masson染色分析子宫内膜纤维化程度、荧光共聚焦显微镜观察PKH26标记的h AMSCs在子宫内膜中的分布情况以及免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF)、CK蛋白在子宫组织中的变化情况。结果:1.h AMSCs经过3次传代后,细胞形态趋于稳定,呈成纤维细胞样。流式结果显示hAMSCs高表达CD29、CD90,几乎不表达CD34、HLA-DR,免疫荧光实验表明hAMSCs主要表达间充质细胞标志物VIM,而不表达上皮细胞标志物CK19。PKH26染色的hAMSCs即时标记率约为100%,PKH26染色剂对h AMSCs的活性、增殖、凋亡、周期等生物学特性无明显影响。2.建模后,大鼠子宫内膜中腺体的数目明显减少,纤维化程度增加(P0.05)。通过治疗,相比B组,各治疗组(C、D、E组)腺体数目均有不同程度的增加,子宫内膜纤维化程度减少,VEGF、CK蛋白的表达量增加,其中E组变化情况最明显,基本恢复到A组的正常水平。荧光共聚焦显微镜下D组和E组可观察到散在的红色荧光,主要分布在大鼠子宫内膜中。结论:PKH26标记技术是追踪h AMSCs在体内分布迁移的安全有效方法。利用机械和感染双重损伤法可以成功建立稳定的IUA动物模型。h AMSCs移植联合雌激素治疗IUA的效果最佳,推测hAMSCs通过分泌VEGF,诱导血管再生,而雌激素为h AMSCs诱导提供了良好的微环境,使hAMSCs活性一直维持在较高的水平,可以更好地促进IUA大鼠子宫内膜的再生修复。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R711.74
【部分图文】：

形态图,间充质干细胞,形态

图 1.1 人羊膜间充质干细胞在显微镜下的形态 (x40)Fig. 1. 1 Morphology of human amniotic mesenchymal stem cells under microscope(x 40)(a) The primary cells in the third day; (b) Cells after passage2.2 人羊膜间充质干细胞的鉴定

免疫表型,间充质干细胞

图 1.2 人羊膜间充质干细胞免疫表型测定Fig. 1.2 The immunophenotype of human amniotic mesenchymal stem cells.(a) CD29 (99.60%, positive); (b) CD90 (98.69%, positive)(c) CD34 (0.45%, negative); (d) HLA-DR (1.04%, negative)

间充质干细胞,角蛋白,波形蛋白

图 1.3 人羊膜间充质干细胞波形蛋白 (a)、角蛋白 (b)的表达情况 (x200)Fig. 1.3 The expression of vimentin (a) and keratin (b) in hAMSCs (x200)2.3 人羊膜间充质干细胞的 PKH26 标记情况

【参考文献】