研究背景宫颈癌是目前女性最常见的妇科恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织(WHO)下属国际癌症研究机构(IRAC)2018年发布的全球癌症(GLOBOCAN)统计报告推算,2018年全球女性宫颈癌新发病例数为569,847人,死亡病例数为31 1,365人,发病比例(13.1%)和死亡比例(6.99%)在全身女性肿瘤中均排在第四位。与此同时,在2015年报导的中国人口癌症统计学报告中发现,中国女性人群的宫颈癌发病率以及死亡率从2000年至201 1年呈现逐年上升的趋势,在34-44岁年龄段女性中发病率高居第二位。因此,宫颈癌在全国乃至全世界范围内仍对社会造成沉重的经济负担,成为危害人类女性健康的杀手。女性宫颈转化区内存在高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)持续性感染,是目前公认的宫颈癌发生发展的主要危险因素,但这个过程缓慢,常持续数十年,且仅有极少数的HPV感染患者进展为宫颈癌,说明除HPV持续感染外,很可能有其它因素参与了致癌过程。因此,探究除HPV持续感染外的宫颈癌致癌机制,对宫颈癌的精准化筛查及治疗都具有重要的意义。2018年美国免疫学家和日本免疫学家共同获得了诺贝尔生理学与医学奖,因为他们共同发现了多种癌细胞表面表达的程序性死亡配体(programmed death ligand 1,PD-L1)会特异性结合患者体内免疫细胞表面的程序性死亡受体(programmed death 1,PD-1),抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,促进肿瘤细胞的免疫逃逸,最终导致了癌症的发生。因此,免疫因素在宫颈癌发生发展的作用值得我们探究。在机体发生免疫反应时,T淋巴细胞会发生增殖及活化,这个过程不仅需要T淋巴细胞受体(T cell receptor,TCR)识别抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)或者肿瘤细胞表面表达的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)提供的第一信号,还需要共刺激分子提呈的第二信号。其中起正性调节激活作用的例如B7.2/CD28,起负性调节抑制免疫功能的有PD-L1/PD-1,PD-L1别名B7-H1(B7 homolog 1),与B7.2都是免疫球蛋白超家族B7家族的成员。大量研究表明,B7家族分子作为免疫调节分子,在机体免疫微环境中既可以起到促进免疫反应发生的正性刺激信号作用,也可以产生负性抑制信号下调免疫反应,这种调节免疫功能的全面性使其迅速成为近年来肿瘤、器官移植以及炎症研究领域的明星家族。B7-H3(B7 homolog 3)和B7-H4(B7 homolog 4)是新近发现的B7家族成员,分别于2013年和2014年被确定相应的蛋白结构。两种蛋白都属于跨膜蛋白,可表达在肿瘤细胞和APC表面。虽然两者配体至今尚未明确,但是目前已经有许多研究证明B7-H3和B7-H4在肺癌、乳腺癌、肾癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、前列腺癌、口腔癌、胰腺癌中呈现高表达并与临床不良预后有关,且有研究表明B7-H3/B7-H4能抑制免疫细胞的增殖和活化,影响IL-10、IFN-γ等细胞因子的分泌,传递负性免疫信号的作用,从而促进了肿瘤的发生与发展。我们检索了相关文章,发现在宫颈癌中B7-H3及B7-H4研究比较少,且二者作用机制尚不明确。本课题拟系统研究B7-H3/B7-H4在宫颈癌发生发展中的作用机制,具体研究内容包括以下两部分:第一部分:B7-H3/B7-H4在宫颈癌中的表达、临床意义及生物学功能研究研究目的:1.检测B7-H3/B7-H4在宫颈癌患者中的表达情况,以及与临床病理因素、临床预后的关系;2.探讨B7-H3/B7-H4对宫颈癌细胞系增殖、凋亡、迁移、侵袭生物学行为的影响和相关作用机制。研究方法:1.制作宫颈癌组织芯片(TMA),并采用免疫组织化学法(IHC)检测B7-H3/B7-H4在正常宫颈、高级别宫颈上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及宫颈癌患者组织中的表达情况,采用卡方检验分析两者与宫颈癌患者相关临床病理因素间的关系,使用Kaplan-Meier法和Log Rank法分析两者与宫颈癌患者临床预后之间的关系;2.使用免疫细胞荧光法(ICC)检测B7-H3/B7-H4在宫颈癌细胞系中的定位情况,构建B7-H3/B7-H4干扰及过表达的的慢病毒载体并建立相应的宫颈癌稳转细胞系。利用CCK-8增殖实验、流式细胞术(周期与凋亡)实验及裸鼠成瘤实验检测其对宫颈癌细胞系增殖和凋亡的影响,利用Transwell方法检测B7-H3/B7-H4对宫颈癌细胞系迁移和侵袭的影响;3、采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)和Western Blot方法检测B7-H3/B7-H4对宫颈癌细胞系增殖、凋亡、迁移及侵袭相关分子的影响及HPV致癌相关通路分子的影响。研究结果:1.B7-H3/B7-H4在宫颈癌及高级别宫颈上皮内病变患者组织中呈现高表达趋势,并与临床不良预后相关:对TMA的免疫组织化学结果进行H-Score评分,发现在高级别宫颈上皮内病变患者中,B7-H3/B7-H4的表达高于良性疾病(子宫肌瘤等)患者正常宫颈,差异结果具有统计学意义(p0.01/0.05),在宫颈癌患者中,B7-H3的表达亦高于正常宫颈及HSIL患者,差异结果具有统计学意义(p0.001/0.01)。同时,Pearson相关检验法证实B7-H3与B7-H4的表达呈正相关关系(r=0.3481,p0.001);卡方检验分析结果表明,B7-H3/B7-H4的表达与宫颈癌深层间质浸润相关(X2=6.095/6.551,p=0.0136/0.0105)。Kaplan-Meier法及Log Rank法分析表明:B7-H3高表达的患者比B7-H3低表达的患者预后差(HR=3.871,95%CI=1.244-12.05),差异结果具有统计学意义(p=0.0194);2.B7-H3/B7-H4能显著增强宫颈癌细胞的增殖、抗凋亡以及迁移侵袭的能力:免疫细胞荧光法检测B7-H3/B7-H4主要定位于宫颈癌细胞的细胞质和细胞膜;当在B7-H3/B7-H4表达较高的宫颈癌细胞系SiHa中干扰B7-H3/B7-H4的表达时,SiHa细胞系的增殖能力下降,凋亡增加,迁移及侵袭能力减弱;当在B7-H3/B7-H4表达较低的宫颈癌细胞系HeLa中过表达B7-H3/B7-H4时,HeLa细胞系的增殖能力上升,凋亡减少,迁移及侵袭能力增强;体外裸鼠成瘤实验结果表明,敲除了B7-H3/B7-H4后,与对照组相比,肿瘤的体积和重量均显著下降;3.B7-H3/B7-H4能影响HPV致癌相关通路E7/Rb通路,并影响增殖、凋亡、迁移、侵袭相关分子的表达:RT-PCR和Western Blot的结果显示,干扰宫颈癌细胞系B7-H3/B7-H4表达后,E7表达水平下降,Rb表达水平上升,细胞增殖相关分子E2F1、P21、P16表达下降,细胞凋亡相关分子PARP-1、Caspase3、Caspase8、Bax表达水平下降,抗凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-xl表达上升,当在宫颈癌细胞系过表达B7-H3/B7-H4时,上述分子呈现相反的趋势。研究结论:1.B7-H3/B7-H4在高级别宫颈上皮内病变及宫颈癌患者中呈高表达,与宫颈癌深层间质浸润相关,B7-H3高表达与临床不良预后相关;2.B7-H3/B7-H4能影响HPV致癌相关通路E7/Rb通路,并影响宫颈癌细胞系的增殖、凋亡、迁移、侵袭相关分子的表达从而发挥致癌作用。第二部分:B7-H3/B7-H4在宫颈癌免疫微环境中的负性调节作用机制研究研究目的:1.检测免疫抑制因子IL-10、TGF-β1在宫颈癌患者中的表达情况,以及与临床病理因素、临床预后的关系,并研究IL-10、TGF-β1与B7-H3/B7-H4表达的相关性;2.构建B7-H3/B7-H4过表达宫颈癌细胞-单核细胞共培养体系,研究B7-H3/B7-H4对单核细胞合成分泌的IL-10、TGF-β1的影响及相关作用机制。研究方法:1.利用前述TMA,使用IHC法检测IL-10、TGF-β 1在正常宫颈、高级别宫颈上皮内病变及宫颈癌患者组织中的表达情况,并分析IL-10、TGF-β1与宫颈癌患者临床病理因素间的关系以及临床预后之间的关系;采用Pearson相关检验分析IL-10、TGF-ββ1与B7-H3、B7-H4表达的相关性;2.采用流式细胞术(周期与凋亡)实验检测共培养体系中单核细胞的增殖及凋亡情况,利用酶联免疫吸附(ELSIA)实验检测共培养体系上清液中IL-10及TGF-β1的变化,采用Western Blot方法检测单核细胞中IL-10、TGF-β 1的表达及其变化;3.利用Western Blot方法检测共培养体系中单核细胞的JAK2-STAT3通路的变化情况;4.利用体外成瘤实验组织进行免疫组织化学染色,分析过表达B7-H3/B7-H4对IL-10、TGF-β 1 的影响。研究结果:1.IL-10及TGF-β 1的表达与B7-H3/B7-H4的表达呈正相关关系:对IL-10及TGF-β 1的TMA的免疫组织化学结果进行H-Score评分,用Pearson相关性检验法证实IL-10与B7-H3/B7-H4的表达呈正相关关系(r=0.2847/0.1693,p0.0001/0.01),TGF-β 1 的表达与B7-H3呈正相关关系(r=0.2480,p0.01)。卡方检验(Fisher确切概率法)结果表明,IL-10的高表达与宫颈癌分化程度相关(χ2=4.884,p=0.0271),TGF-β1的高表达与宫颈癌的淋巴结转移相关(p=0.0050)。Kaplan-Meier法及Log Rank法分析表明,IL-10和TGF-β1 的高表达与宫颈癌患者的生存预后无统计学意义上的相关性(p=0.1509/0.3943);2.宫颈癌细胞过表达B7-H3/B7-H4能促使共培养体系中单核细胞系U-937的增殖,并促进IL-10及TGF-β1的合成与分泌:流式细胞术周期、凋亡实验结果表明,共培养体系中U-937细胞在24、48 h时间点周期循环加速,凋亡减少。Western Blot的结果表明,共培养体系中U-937细胞在24、48 h时间点细胞内IL-10及TGF-β1合成增加。ELISA实验结果显示共培养体系上清液24、48 h时间点IL-10及TGF-β1浓度均有所增加。体外成瘤实验组织进行免疫组织化学染色发现,过表达B7-H3/B7-H4能引起IL-10及TGF-β1的表达增加;3.共培养体系中宫颈癌细胞过表达B7-H3/B7-H4能诱导U-937细胞中JAK2-STAT3通路的激活:Western Blot的结果显示,共培养体系中U-937细胞在24、48 h时间点细胞内磷酸化JAK2(p-JAK2)与总JAK2的比值以及磷酸化STAT3(p-STAT3)与总STAT3的比值均有所上升。研究结论:1、宫颈癌患者宫颈免疫微环境中IL-10及TGF-β1表达含量较高,且与B7-H3/B7-H4呈正相关关系;2、B7-H3/B7-H4过表达能诱导免疫微环境中单核细胞JAK2-STAT3通路的活化,并引起IL-10及TGF-β1的合成及分泌增加,促进了宫颈癌的发生与发展。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：
有研究表明，感染ＨＩＶ的妇女发生宫颈上皮内病变的风险增加，并且经过治逡逑疗后复发或残留的可能性也增高ｉｎ＿邋１２邋，这提示人体的免疫系统可能参与丫邋ＨＰＶ的逡逑持续感染并发展成为宫颈癌的过程。机体清除ＨＰＶ感染的细胞需要免疫效应细胞逡逑识R%递呈抗原、活化、杀伤过程。＜Ｖ：ＩＩＰＶ持续感染发生为宫颈癌的过程中，免疫逡逑效应细胞的功能异常导致的免疫逃逸发挥ｒ重要作川，主要有：（１）自然杀伤细逡逑胞（ｎａｔｕｒａｌ邋ｋｉｌｌｅｒ，邋■）功能异常：在高危型ＨＰＶ持续感染的过程中ｌｕ，邋ＮＫ细逡逑、
两者分别于２００１年、２００３年被克隆，其蛋＆}P构于２０１３年、２０１４年逡逑被确定，但受体尚未明确ｌｉ；ｉ。两者均为跨膜蛋白，既可表达于肿瘤细胞，又可逡逑在抗原提呈细胞ｔ表达（图２邋Ａ，邋Ｂ）。两种分子不仅以膜蛋白形式的存在，在血逡逑清中还有可溶体，主要是其细胞膜蛋白经过金属蛋白酶剪切之后游离产生＂。１３７－逡逑Ｈ３的ｍＲＮＡ和Ｂ７－Ｈ４的ｍＲ＼Ａ可在人类多数正常组织器官上表达，如肝脏、心逡逑脏、子宫等，但两者的蛋白表达谱有限，可能是由于转录后调节的缘故。Ｂ７－Ｈ３逡逑在免疫调节中有拮抗作用，屮期的研究发现Ｂ７－Ｈ３能促进Ｔ淋巴细胞的增殖，逡逑增强ＣＴＬ的杀伤力，加强ＩＦＮｙ的分泌；但近年来大多数研究证实Ｂ７－Ｈ３能抑逡逑制Ｔ淋巴细胞的活化，从而影响体内免疫细胞包括Ｔｈｌ、Ｔｈ２及Ｔｈｌ７等的作逡逑１９逡逑
于正常宫颈组织，并与宫颈癌深层间质浸润相关，Ｂ７－Ｈ３高表达与临床不良预后逡逑相关；Ｂ７－Ｈ３／Ｂ７－Ｈ４在促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭中发挥重要作用，能逡逑影响Ｅ７／Ｒｂ通路及相关分子（图１５）。逡逑４４逡逑
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