邻苯二甲酸二丁酯可能影响孕鼠绒毛膜促性腺激素分泌诱导雄性胎鼠尿道下裂的作用

发布时间：2020-09-10 09:29

　　 第一部分邻苯二甲酸二丁酯影响孕鼠绒毛膜促性腺激素对胎鼠尿道下裂的意义目的通过检测孕期DBP处理后的孕鼠血清中绒毛膜促性腺激素含量的变化,探究胎盘分泌绒毛膜促性腺激素的减少是否会引起后代雄性仔鼠睾丸中wnt/β-catenin通路中关键因子含量的变化,从而对胎鼠睾丸中经典wnt/β-catenin信号通路产生影响,减少StAR蛋白的表达以及睾酮的合成,探讨DBP诱导SD大鼠发生尿道下裂的可能途径,为探究尿道下裂的病因提出新思路。方法(1)选取从苏州大学实验动物中心购得的3月龄雌性SD大鼠45只,合笼后将孕鼠随机分为两组(对照组15只、DBP组30只)。于孕第13天到孕第19天,对孕鼠行灌胃处理,对照组按照3ml/kg体重玉米油的标准灌胃,DBP组将DBP按照800mg/kg的量溶入玉米油并混匀后以总剂量为3ml/kg体重的标准进行灌胃。两组实验动物均置于相同条件下进行饲养。(2)每只孕鼠于孕第13天到孕第19天经内眦静脉取血,离心后保留血清并检测其中绒毛膜促性腺激素水平变化。(3)在孕鼠怀孕第19天(GD19)取出胎鼠,鉴别出两组中的雄性后代,将对照组雄性胎鼠设为正常对照组,DBP组雄性后代中根据尿道口位置鉴别出尿道下裂胎鼠,并设为DBP处理后尿道下裂组,将未发生尿道下裂的雄性胎鼠归入DBP处理后正常组。观察并拍摄各组的生殖结节图片,同时测量所有雄性胎鼠的肛门-生殖结节距离(Anal genital nodule distance,AGD),统计尿道下裂发生率。取出各组胎鼠的生殖结节及睾丸组织,制成石蜡切片后用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)进行染色,于显微镜下观察并拍摄图片。(4)取出胎鼠过程中用断头取血法为各组胎鼠采血,离心后保留血清,检测血清中的睾酮含量。取各组胎鼠睾丸并提取胎鼠睾丸组织的蛋白,应用Western blot方法检测蛋白液中的StAR、GSK-3β、p-GSK-3β以及β-catenin蛋白的表达差异。结果(1)对孕鼠进行DBP处理后,雄性胎鼠的尿道下裂发生率为41.9%;DBP处理后尿道下裂组的尿道口均开口于生殖结节腹侧,对照组和DBP处理后正常组的尿道口开口则均位于生殖结节的顶端。DBP处理后尿道下裂组的AGD(1.61±0.31mm)与DBP处理后正常组的AGD(2.09±0.55mm)数据之间的差别无明显统计学意义,两者均明显小于对照组的AGD(2.93±0.44mm)。两组数据之间的差异是具有统计学意义的。(p0.05)。(2)孕第13天DBP组孕鼠绒毛膜促性腺激素水平与对照组之间无明显差别,孕第14及孕第15天DBP组孕鼠绒毛膜促性腺激素水平稍低于对照组,但数据差别不具有统计学意义。自孕第16天起DBP组与对照组相比孕鼠绒毛膜促性腺激素水平下降且数据具有统计学意义(p0.05)。)(3)DBP处理后尿道下裂组睾酮含量(1.74±0.31ng/ml)对比对照组的睾酮含量(2.97±0.70ng/ml)明显降低,且此此两组数据的差异具有明显统计学意义(p0.05)。而DBP处理后尿道下裂组睾酮含量虽略低于DBP处理后正常组睾酮含量(2.16±0.44 ng/ml),但两组数据之间的差别无统计学意义。(4)进行对比的三组样本的内参(β-actin、GAPDH)亮度基本一致,DBP处理后尿道下裂组StAR、β-catenin和GSK-3β的亮度略低于DBP处理后正常组,但均明显低于正常对照组。相反p-GSK-3β(Ser9)的亮度则明显高于其余两组。结论DBP通过降低孕鼠血清中的绒毛膜促性腺激素水平,影响胎鼠睾丸中wnt/β-catenin通路中的关键因子的含量,从而影响StAR的表达,进而使睾丸中睾酮合成障碍,达到影响雄性胎鼠外生殖器发育的目的。第二部分邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠睾丸间质细胞分化的影响及意义目的研究邻苯二甲酸二丁酯对胎鼠睾丸间质细胞分化的影响,探讨邻苯二甲酸二丁酯导致大鼠尿道下裂发生的可能机制。方法(1)将45只孕龄雌性SD大鼠配种并随机分为对照组和DBP组。于孕第13天到孕第19天对孕鼠进行灌胃,DBP组按照800mg/kg体重DBP溶入玉米油(DBP和玉米油总剂量为3ml/kg体重)后灌胃,对照组按照3ml/kg体重玉米油灌胃,在将两组大鼠置于相同条件下进行饲养。(2)于孕第19天取出胎鼠,鉴别出对照组中的雄性胎鼠,DBP处理后发生尿道下裂组的雄性胎鼠,与对照组中的雄性胎鼠一起分为尿道下裂组和正常对照组。(3)分别提取两组胎鼠的睾丸组织,用差速贴壁法所获得原代睾丸间质细胞,并于不同培养阶段(2小时,12小时及48小时)对睾丸间质细胞标志物3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)进行检测,测试其细胞活性及分泌功能。(4)取对照组雄性胎鼠睾丸组织,用差速贴壁法所获得的原代睾丸间质细胞,原代培养2小时后用DBP配制染毒液染毒培养,按照染毒液浓度分为对照组(0μmol/L)及实验组(62.5、125、250、500、1 000μmol/L)。进行染毒处理培养12小时后对睾丸间质细胞标志物3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)进行检测,测试其细胞活性及分泌功能。结果(1)尿道下裂模型建立结果见第一部分。(2)所有细胞生长状态良好,原代培养2小时后,DBP组及对照组的睾丸间质细胞均为圆形,贴壁生长;对照组睾丸间质细胞在进行原代培养12小时后呈铺展状态,几乎所有细胞呈现分枝状生长,仅部分细胞保留长梭形;细胞培养48小时后对照组细胞完全铺展,全部呈现分枝样。DBP组睾丸间质细胞在原代培养12小时后,大多数仍停留在长梭形状态,部分聚集称为绳索状;细胞培养48小时后开始呈现铺展状态,呈现分枝状。培养过程中细胞形态未发现突变。(3)对照组在培养24小时后已出现长梭形细胞,且3β-HSD特异性染色阳性率高于染毒组。DBP染毒组浓度低于250μmol/L的三组细胞培养24小时后同样出现梭形细胞,但3β-HSD染色阳性率低于于对照组。而染毒浓度为500μmol/L以及1000μmol/L的两组细胞无论从分化程度上还是3β-HSD阳性率上都明显下降。结论DBP可能通过对胎鼠睾丸间质细胞由胎儿型向成熟型转变的过程产生影响,降低胎鼠睾丸的睾酮分泌,影响雄性胎鼠外生殖器发育进程而导致尿道下裂的发生。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R714
【部分图文】：

邻苯二甲酸二丁酯可能影响孕鼠绒毛膜促性腺激素分泌诱导雄性胎鼠尿道下裂的作用逦第一部分逡逑表２尿道下裂模型ＡＧＤ相关参数（）逡逑孕鼠逦雌鼠逦正常雄性胎鼠尿道下裂胎鼠逡逑ＤＢＰ邋组逦３０逦１．６１±０．４２ｍｍ逦２．０９±０．５５ｍｍ逦１．６１±０．３１ｍｍ逡逑对照组逦１５逦１．７１±０．３８ｍｍ逦２．９３±０．４４ｍｍ逦逦逡逑与对照组相比，＊ｐ＜０．０５逡逑

１．ＥＬＩＳＡ结果显示：ＤＢＰ组孕鼠自孕第１４天（ＧＤ１４）起到孕第１９天（ＧＤ１中绒毛膜促性腺激素水平低于对照组，自孕第１６天（ＧＤ１６）起两组的差异学意义（表３，图２，／＞＜０．０５）。逡逑表３母鼠孕１３－１９天血清中绒毛膜促性腺激素的表达逡逑组逦ＤＢＰ组逦对照组逡逑邋含量逦ＧＤ１３逦１９＿７４±１．６１逦２０．４０±０．６０逡逑ＧＤ１４逦１９＿３５邋土邋１．９１逦２０．９７±０．７４逡逑ＣＧ逦ＧＤ１５逦１９．４９±１．５３逦２１．５７±０．８８逡逑Ｕ／ｍｌ）逦ＧＤ１６逦１９．７９±１．４７＊逦２２．１９±１．３３逡逑±１？）逦ＧＤ１７逦１９．１３士１．９９＊逦２３．０５±１．６５逡逑ＧＤＩ邋８逦１９．０７＋２．７８＊逦２３．５６±１．６８逡逑ＧＤ１９逦２０．３９±１．９３＊逦２２．９４士邋１．８０逡逑与对照组相比，＊ｐ＜０．０５逡逑３０邋ｎ逡逑

酯可能影响孕鼠绒毛膜促性腺激素分泌诱导雄性胎鼠尿道下裂的作用后尿道下裂组胎鼠的血清中的睾酮含量（１．７４±０．３１邋ｎｇ／ｍｌ）之间。逡逑表４胎鼠血清中睾酮的表达水平（ｉ邋±邋Ｓ邋）逡逑正常雄性胎鼠逦ＤＢＰ处理后正常组邋ＤＢＰ处理后尿２０逦２０逦２０逡逑２．９７±０．７０逦２．１６±０．４４逦１．７４±０．３１组相比，％＜０．０５逡逑４－

【参考文献】

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本文编号：2815662