卵巢癌(ovarian cancer)是导致女性死亡的第五种最常见的癌症,由于症状出现较晚,大多数患者诊断为晚期(III-IV),这些患者的5年相对生存率仅为29%。其组织学类型较多,最常见的类型为上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer)。晚期疾病患者通常存在腹水积聚,促进肿瘤细胞在腹腔内扩散。标准的治疗方法包括手术切除肿瘤以缩小肿瘤体积,然后以铂为基础的化疗。此法虽能提高肿瘤细胞对放疗的敏感性,但长期化疗会引起免疫抑制,升高外周耐受性,导致耐药的获得或产生,因此迫切需要发展新的治疗手段。肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗学发展的方向之一,指通过激活或增强机体免疫系统的抗肿瘤免疫反应,控制或消除肿瘤细胞的方法,免疫治疗的目的是发展联合方法,在增强免疫的同时防止局部免疫抑制,免疫治疗的进展为卵巢肿瘤的治疗提供了广阔的前景。免疫检查点是存在于免疫系统中的抑制性信号通路,对外周组织中免疫反应强度、持续性予以调节,防止组织损伤,并在维持自身抗原耐受性的过程中发挥作用。近年研究发现,免疫检查点在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过各种机制逃避免疫系统的识别和攻击而生长和转移的现象,是肿瘤生存和发展的重要策略。程序性死亡配体受体-1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、吲哚胺2,3-双加氧化酶-1(IDO-1)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)等,它们被称为免疫检查点,可抑制效应T淋巴细胞的活化,最终导致肿瘤免疫逃逸。人类PD-1是由位于染色体2q37上的PDCD1基因编码的一种Ⅰ型跨膜蛋白,由288个氨基酸残基组成,属于免疫球蛋白CD28家族,PD-1蛋白是一种分子量为55-60 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外IGV样区、疏水性跨膜区和胞内区组成。PD-1胞内区的C-端和N-端氨基酸残基有两个独立的磷酸化位点:免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基开关基序(ITSM)。PD-L1(B7-H1或CD274)是发现的第一个PD-1配体,属于B7家族,位于人类染色体9p24.2上,其氨基酸结构与PD-1类似。当PD-1与PD-L1结合时,ITSM区域被磷酸化,激活一系列细胞内信号通路,抑制免疫细胞的激活,从而减少免疫细胞分泌抗体和细胞因子,甚至耗尽免疫细胞,实现有效的免疫抑制。TIM-3又称HAVCR2,属于TIM基因家族。在人类中,TIM家族包括TIM-1、TIM-3和TIM-4,位于染色体5q33.2上。它们具有相似的结构:可变免疫球蛋白结构域(IGV)、胞外区不同长度的糖基化粘蛋白结构域和单个跨膜区,除了TIM-4外,所有TIM分子还含有一个C末端的磷酸化细胞质尾。具有保守的基于酪氨酸的信号基序GAL-9是第一个被发现的配体,它是一种糖结合蛋白,能特异性识别TIM-3免疫球蛋白可变区N-糖链的结构,TIM-3与Gal-9结合后促使钙离子内流到Th1细胞的胞内区,从而诱导细胞凋亡。目前,关于PD-1和TIM-3在上皮性卵巢癌中的联合研究较少。有研究表明,在其他多种恶性肿瘤如胃癌、结直肠癌、甲状腺癌等肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)上共表达PD-1及TIM-3,联合阻断TIM-3和PD-1往往比单独阻断PD-1产生更好的抗肿瘤效果。目的本研究拟通过免疫组化和qRT-PCR法检测PD-1与TIM-3在不同卵巢组织中的蛋白阳性表达率及mRNA的表达情况,从而为以PD-1和TIM-3为联合靶点进行抗癌治疗提供思路和契机。研究对象和实验方法1.研究对象:收集2016年9月至2018年3月在郑州大学第三附属医院住院并行手术切除卵巢组织的患者共100例,年龄为(13~69)岁,中位年龄48岁。其中正常卵巢上皮组织30例(正常组),标本来源于因宫颈癌或其他良性疾病行附件切除,术后经病理证实为正常卵巢上皮组织;卵巢良性上皮性肿瘤组织30例(良性组),上皮性卵巢癌组织40例(恶性组)。所有病例术前均未接受放化疗、药物等治疗,除外其他脏器转移性癌,术后组织标本均经病理学确诊。所有组织收集通过郑州大学第三附属医院伦理委员会批准,并取得患者知情同意。2.实验方法:(1)采用免疫组化SP法分别检测正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中PD-1和TIM-3蛋白的阳性表达率。(2)采用qRT-PCR法分别检测正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中PD-1和TIM-3 mRNA的表达水平。3.统计学方法:采用SPSS21.0进行统计分析。正态分布计量资料用x±s表示,偏态分布计量资料用M(中位数)表示,计数资料用百分率(%)表示。应用R×Cχ~2检验和Fisher确切概率法分析三种卵巢上皮性组织中PD-1及TIM-3蛋白阳性表达率及两者的表达与不同临床病理参数的关系。应用单因素方差分析比较正常组、良性组及恶性组卵巢组织中PD-1及TIM-3 mRNA表达水平,组间两两比较采用Dunnett’T3法。PD-1及TIM-3蛋白表达的相关性采用Spearman相关分析,设检验水准α=0.05。结果1.三组卵巢组织中PD-1、TIM-3蛋白的表达PD-1及TIM-3蛋白阳性表达均定位于细胞膜和细胞质中,显微镜下呈棕黄色颗粒状分布。PD-1蛋白在正常组、良性组和恶性组中的阳性表达率分别为6.7%(2/30)、36.7%(11/30)、75%(30/40),恶性组的阳性表达率明显高于正常组和良性组,差异具有统计学意义(P0.001),良性组的阳性表达率高于正常组,差异具有统计学意义(P0.001)。TIM-3蛋白在正常组、良性组和恶性组中的阳性表达率分别为10%(3/30)、43.3%(13/30)、85.0%(34/40),恶性组的阳性表达率明显高于正常组和良性组,差异具有统计学意义(P0.001),良性组的阳性表达率高于正常组,差异具有统计学意义(P0.001)。2.PD-1和TIM-3蛋白阳性表达与上皮性卵巢癌临床病理特征之间的关系PD-1蛋白在FIGO分期I-II期和III-IV期上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率分别为50%(7/14)、88.5%(23/26),随着手术病理分期增高,PD-1蛋白的阳性表达率增加,差异具有统计学意义(P㩳0.05)。术后经病理证实有淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织PD-1蛋白的阳性表达率为88.9%(16/18),显著高于无淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织PD-1蛋白的阳性表达率50.0%(6/12),差异具有统计学意义(P㩳0.05)。但PD-1蛋白的表达与患者年龄、组织学分型和组织分化程度无关(P0.05)。TIM-3蛋白在高、中、低分化上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率分别为40.0%(2/5)、83.3%(10/12)、95.7%(22/23),差异具有统计学意义(P㩳0.05)。术后经病理证实有淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织TIM-3蛋白的阳性表达率为100.0%(18/18),显著高于无淋巴结转移的上皮性卵巢癌组织TIM-3蛋白的阳性表达率66.7%(8/12),差异有统计学意义(P㩳0.05)。但TIM-3蛋白表达与患者年龄、组织学分型和FIGO分期无关(P0.05)。3.三组卵巢组织中PD-1、TIM-3 mRNA的表达正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织和上皮性卵巢组织中PD-1 mRNA的相对表达量分别为0.037±0.019、0.149±0.039和0.678±0.275。恶性组中PD-1 mRNA的相对表达量高于良性组和正常组,差异具有统计学意义(P0.05)。良性组中PD-1 mRNA的相对表达量高于正常组,差异具有统计学意义(P0.05)。正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织和上皮性卵巢组织中TIM-3 mRNA的相对表达量分别为0.037±0.020、0.179±0.076和0.665±0.271。恶性组中TIM-3 mRNA的相对表达量高于良性组和正常组,差异具有统计学意义(P0.05)。良性组中PD-1 mRNA的相对表达量高于正常组,差异具有统计学意义(P0.05)。4.PD-1和TIM-3在上皮性卵巢癌组织中表达的相关性经Spearman相关分析得出,PD-1蛋白和TIM-3蛋白在上皮性卵巢组织中的表达呈正相关(r=0.566,P㩳0.001)。结论1.在上皮性卵巢癌中PD-1及TIM-3蛋白阳性表达及其mRNA表达水平均显著高于正常卵巢上皮组织及良性上皮性卵巢肿瘤组织。2.在上皮性卵巢癌中PD-1蛋白表达水平可以预测临床病理分期和淋巴结有无转移;TIM-3蛋白表达水平可以预测组织分化程度和淋巴结有无转移。3.在上皮性卵巢癌中PD-1及TIM-3表达呈正相关,可能协同参与了上皮性卵巢癌的发生发展。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：
图 3.1 三种组织中 PD-1 蛋白阳性表达（SP，×400 倍）注：A1 正常卵巢组织 A2 浆液性囊腺瘤 A3 黏液性囊腺瘤 A4 浆液性囊腺癌 A5 黏液性囊腺癌图 3.2 三种组织中 TIM-3 蛋白阳性表达（SP，×400 倍）注：B1 正常卵巢组织 B2 浆液性囊腺瘤 B3 黏液性囊腺瘤 B4 浆液性囊腺癌 B5 黏液性囊腺癌3.1.2 PD-1 和 TIM-3 蛋白阳性表达与上皮性卵巢癌临床病理特征之间的关系PD-1蛋白在FIGO分期I-II期和III-IV期上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率分别为 50%（7/14）、88.5%（23/26），随着手术病理分期增高，PD-1 蛋白的阳性表达率增加，差异具有统计学意义（P㩳0.05）。术后经病理证实有淋巴结
3.1.1.2 三组卵巢组织中 PD-1、TIM-3 蛋白阳性表达定位PD-1 蛋白及 TIM-3 蛋白阳性表达均定位于细胞膜和细胞质中，显微镜下呈棕黄色颗粒状分布。（见图 3.1 和图 3.2）图 3.1 三种组织中 PD-1 蛋白阳性表达（SP，×400 倍）注：A1 正常卵巢组织 A2 浆液性囊腺瘤 A3 黏液性囊腺瘤 A4 浆液性囊腺癌 A5 黏液性囊腺癌
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2819369
