miR-652在子宫内膜癌发生发展中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-17 22:08

　　 背景与目的子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,发病率位居女性常见恶性肿瘤的第四位,且仍在不断上升。传统的EC分类方法是二分类法,依据临床病理特征和发病机理将EC分为两型:Ⅰ型(雌激素依赖型)和Ⅱ型(非雌激素依赖型)。然而,最近的研究发现,相同类型的EC在分子和形态学特征上存在异质性,因此一些研究基于分子突变等特点将EC分为不同亚型,以助于更好的个体化治疗及预后风险评估。尽管EC的总体预后较好,五年生存率可达82%,但是不同于许多其他类型恶性肿瘤近年来死亡率不断下降,EC的死亡率从2010年到2015年间以每年2%的速率在不断增长。EC预后的影响因素有很多,包括肿瘤的分期、分级以及淋巴结转移等,但是目前对EC的疾病进展机制并不十分明确,对于晚期患者仍缺乏有效的治疗方法。因此,我们亟须对EC进展的分子机制进行更加深入的研究,以利于对EC患者进行精准诊断和治疗,从而提高患者预后。MicroRNA(miRNA)为一类长度约22个核苷酸的非编码蛋白质的RNA序列,近年来已被证实其在恶性肿瘤的发病和进展中发挥重要作用。miRNA主要通过种子序列与靶基因的互补序列识别,通过完全或部分互补的方式结合,使得靶基因在mRNA水平降解或者抑制其翻译成蛋白质,进而降低靶基因的转录后表达水平,该序列常位于3'非翻译区(un-translational region,UTR)。目前认为miRNA可以参与包括肿瘤的增殖、转移在内多种生物学过程,并可调控接近三分之一人类基因的转录后水平。尽管现在已经有研究发现,有多种miRNA在EC组织与正常子宫内膜组织中的表达存在差异,但是miRNA在EC发生发展中的确切作用机制尚不明确。现已有研究发现,miR-652通过作用于不同的靶基因在多种恶性肿瘤的发病及进展中发挥重要功能,其中在乳腺癌和骨肉瘤中,miR-652能够促进肿瘤的进展,发挥促癌作用;而在恶性胸膜间皮瘤中miR-652抑制肿瘤侵袭迁移,发挥抑癌作用。但其在EC中的作用及机制目前尚无深入的研究。因此,本课题主要研究方向为miR-652在EC中的异常表达及其在EC疾病进展中的作用,探究miR-652在EC中发挥作用的机制,为EC患者的治疗提供新的治疗思路。研究内容分以下三个部分:1、miR-652在子宫内膜癌中的表达及临床意义;2、miR-652在子宫内膜癌中对增殖转移能力的影响;3、miR-652在子宫内膜癌中下游靶基因的筛选鉴定及功能研究。第一部分miR-652在子宫内膜癌中的表达及临床意义研究目的:miR-652的表达在多种恶性肿瘤中存在异常表达。本课题组通过对癌症基因图谱(The cancer genome atlas,TCGA)数据库中EC的miRNA表达水平进行分析,发现miR-652在EC组织中的表达水平明显高于正常子宫内膜组织。本研究的主要目的在于验证miR-652在EC组织中的表达情况,并通过对TCGA数据库中的临床信息进行分析,发现miR-652的表达与EC临床数据的相关性,探究miR-652在EC临床应用中的重要价值。研究方法:对TCGA数据库进行分析,发现在EC组织和正常子宫内膜组织中差异表达的miRNA。收集山东大学齐鲁医院从2015年4月至2017年12月期间手术的EC组织标本共74例,其中正常子宫内膜组织22例,子宫内膜浆液性癌组织13例,子宫内膜样腺癌组织39例。提取收集组织中RNA,反转录后通过qRT-PCR对TCGA数据库分析所得差异表达miRNA进行组织验证。最后综合文献查阅、组织验证及miRNA在EC细胞中的功能,确定要进行进一步的研究miRNA。应用Cox回归分析miRNA的表达水平与EC患者预后的相关性,并对TCGA中的组织分期、分级、淋巴转移、腹水细胞学等临床数据和miRNA表达进行分析,发miRNA与临床信息的相关性,确定其临床应用中的意义及价值。研究结果:通过对TCGA数据库分析筛选出56个在EC组织和正常子宫内膜组织中差异表达的miRNA,其中miR-652在EC组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织,且为肿瘤特异性;通过对TCGA数据库分析发现,miR-652在EC组织中的表达水平明显高于正常子宫内膜,组织标本qRT-PCR验证所得结果与TCGA数据一致,并且发现miR-652在子宫内膜浆液性癌组织中的表达高于子宫内膜样腺癌组织,结果具有统计学差异;组织及细胞水平验证发现,在EC组织中,miR-652的表达与患者的月经周期及是否绝经无明显相关,在EC细胞中,在培养基中加入不同浓度的雌激素对miR-652的表达无明显影响;;应用Cox回归分析发现,EC组织中miR-652的高表达与患者的不良预后有关,miR-652的表达水平越高,患者的总生存期越短:进一步临床信息数据分析发现,miR-652的表达水平还与EC组织的分级及患者的复发密切相关,miR-652高表达的EC组织分级较高,患者的复发风险较大。研究结论:miR-652在EC组织中的表达高于正常子宫内膜组织;miR-652高表达的EC患者预后相对较差;miR-652有望成为EC患者预测复发及评估预后的重要指标。第二部分miR-652在子宫内膜癌中对增殖转移能力的影响研究目的:研究证实miRNA参与恶性肿瘤发生发展中的多个生物学过程,包括增殖、转移、凋亡、自噬等。miR-652在多种恶性肿瘤的表达存在异常,并发挥不同的功能。在EC中,本课题组前期研究显示miR-652在EC组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织,但miR-652在EC发生发展中的作用及机制尚无明确研究。本研究主要通过调控EC细胞系中miR-652的表达,在体内及体外水平研究miR-652在EC中的生物学功能,发现miR-652在EC的诊断、疾病进展及治疗中的应用价值。研究方法:应用两种EC细胞系(Ishiakwa,AN3CA)瞬时转染miR-652的mimics及inhibitor,分别过表达及干扰EC细胞系中miR-652的表达水平。在体外实验中,通过MTT实验及平板克隆实验,检测miR-652对EC细胞增殖能力的影响;应用流式细胞学检测,研究miR-652对EC细胞在周期及凋亡方面的影响;通过划痕实验及transwell实验,研究miR-652在EC细胞侵袭和迁移方面的作用;Western blot实验检测EC细胞中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal tranition,EMT)相关蛋白的表达变化。在体内实验中,应用pGIPZ载体构建miR-652稳定过表达的EC细胞系,用miR-652过表达细胞及其对照细胞,分别进行小鼠皮下成瘤实验及小鼠腹腔肿瘤细胞种植实验,在体内水平检测miR-652对EC增殖和转移能力的影响。研究结果:通过瞬时转染分别构建了miR-652过表达及干扰的细胞系,应用pGIPZ载体成功构建了miR-652稳定过表达的细胞系;在体外实验中,通过MTT和平板克隆实验发现,过表达miR-652能够使细胞的增殖能力明显增强,干扰miR-652能抑制EC细胞的增殖;细胞形态观察发现,miR-652稳定过表达的细胞形态向间质转化,Transwell实验结果显示,过表达miR-652还能促进EC细胞的侵袭和迁移能力,抑制miR-652的表达使细胞的侵袭和迁移能力明显减弱;细胞划痕实验显示过表达miR-652能促进EC细胞的划痕愈合能力,干扰miR-652能抑制EC细胞的划痕愈合能力;Western blot实验显示,过表达miR-652后,与EMT相关的指标发生明显变化,ZEB1、N-cad、Slug、Snail等促进EMT的指标表达增强,E-cad等抑制EMT的指标表达减弱;在体内水平实验中,裸鼠皮下成瘤实验结果显示,过表达miR-652组小鼠的皮下肿瘤的体积及重量明显大于对照组,结果具有统计学差异,腹腔肿瘤种植实验结果显示,miR-652过表达组小鼠腹腔中肿瘤形成的个数及体积明显大于对照组,研究表明miR-652在体内及体外水平均能促进EC的增殖和转移;流式细胞学实验结果显示,过表达miR-652能促进细胞周期,但对细胞的凋亡能力无明显的影响。研究结论:miR-652在能够促进EC的增殖及转移,在EC中发挥癌基因的作用,促进EC的疾病进展。第三部分 miR-652在子宫内膜癌中下游靶基因的筛选鉴定及功能研究研究目的:研究发现miR-652在不同肿瘤中可通过与不同的靶基因结合发挥各自的生物学作用。本课题组已研究发现miR-652在子宫内膜癌中能够促进肿瘤细胞的增殖及转移,发挥癌基因的功能,但是miR-652的在EC中发挥作用的具体机制尚待研究。本研究主要是对miR-652的下游靶基因进行筛选验证,研究下游靶基因在EC中的作用,探究miR-652在EC中发挥作用的具体机制。研究方法:对Targetscan,miRNAMap,miRDB等靶基因预测网站检索结果进行筛选,结合对miR-652过表达及对照细胞测序结果分析,发现miR-652可能的靶基因。应用qRT-PCR及Western blot实验分别在RNA及蛋白水平检测EC细胞中过表达及干扰miR-652后RORA的表达水平变化。检测EC组织和正常子宫内膜组织中RORA在RNA及蛋白水平的表达差异。应用IHC检测RORA在小鼠皮下形成肿瘤中的表达强度及EC组织和正常子宫内膜组织中的表达差异。分析RORA的3'UTR区域是否存在miR-652的结合位点。为验证miR-652是否与RORA直接结合,构建RORA的3'UTR的pmirGLO载体,进行luciferase实验。应用Rescue实验进一步验证miR-652是否通过RORA在EC中发挥促进肿瘤进展的作用。对RORA的下游基因进行研究,探索RORA在EC中发挥作用的机制。研究结果:通过Targetscan,miRNAMap,miRDB等靶基因预测网站检测结果筛选发现,RORA的3'UTR区域存在miR-652种子序列的结合位点,在细胞测序结果中发现,过表达miR-652后,RORA在RNA水平的表达下降,说明RORA可能是miR-652的下游靶基因;通过TCGA数据库分析发现,RORA在EC组织中的表达低于正常子宫内膜组织,qRT-PCR及Western blot实验检测所得结果与TCGA数据库相一致;qRT-PCR实验结果显示,在EC细胞系中过表达miR-652能降低RORA在RNA水平的表达,Western blot实验所得结果同qRT-PCR实验结果一致;在IHC研究中,通过对免疫组化染色强度评分发现,RORA在EC组织中的染色强度低于正常子宫内膜组织,且RORA的染色强度与患者是否绝经及所处月经周期无明显相关,在裸鼠皮下形成肿瘤中,过表达miR-652组RORA的染色强度低于对照组;Luciferase实验显示,过表达miR-652能使野生型pmirGLO-RORA载体的荧光强度减弱,突变miR-652的结合位点后,荧光强度变化不明显,说明RORA的3'UTR区域存在miR-652的结合位点;Rescue实验结果发现,过表达RORA能够拯救miR-652过表达导致的EC细胞增殖及转移能力增强;为进一步验证RORA在EC中的作用及机制,通过MTT及平板克隆实验发现,干扰RORA能够促进EC细胞的增殖能力,Transwell实验显示,干扰RORA能使EC细胞的迁移能力增强;Western blot实验发现,干扰RORA能促进β-catenin的表达,以上结果显示RORA在EC中发挥抑癌作用,且与β-catenin有关。研究结论:在EC中,RORA是miR-652的直接下游靶基因。miR-652通过调节miR-652/RORA/β-catenin通路在EC中发挥促癌作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

图１．邋ＥＣ组织与正常子宫内膜组织间差异表达ｍｉＲＮＡ的非监督聚类逡逑系统树图显示正常子宫内膜组与ＥＣ组分别聚为一支。Ｎ表示正常子宫内膜组ＥＥＣ表示子宫内膜样腺癌组织。红色代表高表达水平，蓝色代表低表达水平。逡逑４０逡逑

图２．邋ｍｉＲ－６５２在ＥＣ组织中存在氋表达逡逑（Ａ，Ｂ）验证ＴＣＧＡ数据库中ｉｎｉＲ－ｌ８２－５ｐ与ｍｉＲ－４２９在ＥＣ组织与正常对照中的表逡逑达。（Ｃ）在ＴＣＧＡ数据库中，ｍｉＲ－６５２在ＥＣ组织中的表达高于正常对照组织。逡逑（Ｄ）ｑＲＴ－ＰＣＲ验证ｍｉＲ－６５２在ＥＣ组织中的表达高于正常子宫内膜组织，且在ＥＳＣ逡逑中的表达水平高于ＥＥＣ。逡逑

图３．邋ｍｉＲ－６５２在ＥＣ组织中的高表达为肿瘤特异性，与雌激素水平无关逡逑（Ａ）逦ＴＣＧＡ数据分析结果示绝经前后患者ＥＣ组织中ｍｉＲ－６５２的表达无明显差别。逡逑（Ｂ）正常子宫内膜组织中，ｍｉＲ－６５２的表达水平与月经周期无关；ＥＣ组织中，逡逑ｍｉＲ－６５２的表达水平与是否绝经无关。（Ｃ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔＥＣ细胞系中ＥＲ邋ａ在蛋逡逑白水平的表达。（Ｄ）在Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞中，ｍｉＲ－６５２的表达水平与Ｅ２浓度及作用逡逑时间无明显相关性。逡逑

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本文编号：2821296