孕激素受体拮抗剂对原代子宫肌瘤PR-M阳性细胞中增殖与凋亡的影响

发布时间：2020-09-18 18:47

　　孕激素M受体(progesterone receptor mitochondrial,PR-M)是近些年发现的存在于线粒体外膜的一种新型孕激素受体,其独特线粒体定位特征决定其功能,研究发现孕激素可以通过孕激素M受体上调线粒体膜电位促进子宫平滑肌细胞的异常增殖。我们前期研究发现孕激素M受体在子宫平滑肌瘤与正常瘤旁组织相比,肌瘤组织中孕激素M受体明显高表达。通过剂量依赖的形式诱导原代培养和永生化子宫平滑肌细胞线粒体膜电位的增加,证明PR-M受体使细胞能量代谢增加、增值的非基因组作用。但具体作用机制尚未完全明确~([1])。本研究提出的假说是:孕激素通过PR-M上调促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2,促进肌瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡,从而参与子宫平滑肌瘤的发生发展,这种作用可以被孕激素受体拮抗剂所抑制。子宫肌瘤是女性生殖道肿瘤中发生的最常见的类型,并从单一的肌层平滑肌细胞克隆性增殖的发展,最初由细胞的遗传变化引起的。在复杂的信号转导通路,如激素、生长因子等因素的改变,转化生长因子(TGF-β),(WNT)/β-连环蛋白,视黄酸(RA)为子宫肌瘤的发展的重要作用。此外,这些信号因子可能通过共同的因素调节,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白kinase B(也称为Akt)的多个途径。增进肿瘤成长的首要原因包含遗传、激素、免疫和环境等原因。目前,除了外科手术如子宫切除术、子宫肌瘤剔除术、子宫动脉栓塞(UAE)和磁共振成像引导聚焦超声手术(MRgFUS),子宫肌瘤聚焦在缓解症状,减慢或阻止肿瘤发展的药物的策略。治疗三类主要用于减轻症状,抑制肌瘤细胞增殖,即非甾体类抗炎药(NSAIDs)、促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)和拮抗孕激素活性合成类固醇,包括米非司酮和所有。作为一种治疗策略,外科手术与手术死亡率和发病率有关,药物治疗也因其副作用而受到限制。促性腺激素释放激素激动剂可以减轻出血和大量相关的症状,但也可能造成重大的更年期的副作用。米非司酮(Mifepristone,MIF)被称为妇科药物的中流砥柱。作为孕激素拮抗剂和其他激素治疗改变雌激素和孕激素的生产或功能可能会影响生育能力。MIF可缩小肌瘤体积,安全、有效、经济的子宫肌瘤的术前辅助药物。通过手术中收集患者子宫平滑肌瘤手术标本提炼原代培养的细胞作为基础,使用免疫组织化学法进行平滑肌细胞鉴定,使用免疫蛋白印迹法作用于原代培养细胞株筛选表达孕激素M受体阳性并孕激素A/B阴性的细胞株,使用MIF干预在不同时间、不同浓度梯度的浓度后,通过使用MTT比色法与流式细胞法检测阳性实验组和阴性对照组组原代培养肌瘤增殖与凋亡的相关研究。使用Western blot检测Caspase3和Bcl-2的表达水平。探讨与对于指导临床孕激素的合理应用有重要意义,同时为肌瘤的预防和治疗提供理论依据,甚至开辟新的治疗思路,具有广阔的社会和经济应用前景。材料与方法1研究对象于郑州大学第三附属医院妇科住院病人中随机选择2016年8月至2017年1月中因单纯子宫肌瘤行开腹子宫肌瘤挖除术的患者10例,年龄32~47岁,平均(41±3.36)岁。术前至少6个月内未使用类固醇激素,同时没有合并性激素相关疾病。标本均经病理证实,手术中肌瘤细胞的采集均经患者知情同意,并通过郑州大学第三附属医院伦理委员会审核。术中无菌条件下切除2-3块1立方厘米的平滑肌瘤组织,放入4℃含双抗的DMEM试管内,置入冷藏箱到细胞间处理,用无菌培养皿浸泡于PBS液3-5min,使用高压灭菌眼科剪将肌瘤组织剪碎。2试验方法(1)培养皿中细胞培养24h贴壁后进行第一次换液,以后2-3天左右进行一次换液,当培养皿中细胞融合后用配好的试剂胰蛋白酶进行消化传代。利用显微镜高倍镜下观察培养瓶中细胞形态。并经免疫组化确定子宫平滑肌瘤细胞。(2)首先使用蛋白免疫印迹法分别测出高表达孕激素受体M、孕激素受体A和孕激素受体B的的细胞株,从中筛选出PR-M阳性细胞株作为实验组,PR-M(-)阴性细胞株作为对照组,阳性对照T47D乳腺癌细胞株是同时表达孕激素受体M、A、B细胞特异性抗体。(3)实验分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、对照组,其中孕激素受体拮抗剂(MIF)浓度分别为10~(-4),10~(-5),10~(-6)mol/L,空白对照。处理时,对照组加入相同剂量的培养基。(4)通过MTT法分别检测孕激素受体M阳性组与阴性组高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞增殖抑制率,每孔90μl,每组6个复孔。待细胞贴壁后,按上述分组加药处理,培养48小时后在96孔板内加入20μl混合液,在450nm酶标仪下测吸光度,重复三次。增殖抑制率=(对照组OD450nm-实验组OD450nm)/(对照组OD450nm-空白组OD450nm)×100%。(5)通过取对数生长期的子宫肌瘤细胞,在6孔板内以1.0×10~5/孔培养,根据高、中、低浓度组和对照组加入不同浓度孕激素受体拮抗剂,培养48h后,收集细胞于15ml的离心管,加入4℃预冷的PBS缓冲液。将离心管置于离心机内,设置转速为800rpm,离心5min,取出后小心吸去上清液,加入100μl的Binding Buffer重悬细胞,1小时内进行流式细胞仪检测。实验重复3次。(6)Western blot检测按照MIF浓度分为高、中、低浓度组和对照组干预后,孕激素M受体阳性组随着MIF浓度增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表达逐渐降低,凋亡促进蛋白Caspase3的表达逐渐增强。其中与对照蛋白表达量均有统计学意义(P0.05)。结果1.实验为了增加原代细胞培养成功率及细胞数量,通过缩短标本运输时间和及时清洗肌瘤细胞,成功建立了9例子宫肌瘤体外细胞模型。倒置相差显微镜细胞形态观察:细胞接种培养1天后,观察贴壁状况,随后肌瘤细胞呈梭形或不规则生长。7天左右细胞数量达高峰,并出现层叠排列及典型的“峰-谷”,通过免疫组化实验确定该细胞是子宫平滑肌瘤细胞。(图1—2)。2.蛋白免疫印迹法于子宫肌瘤细胞中选出PR-M阳性细胞株(PR-M(+)/PR-A/B(-))作为实验组,PR-M(-)阴性细胞株(PR-M(-)/PR-A/B(+))作为对照组。3.MIF作用于两组细胞干扰48h后,PR-M阳性高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞增殖抑制率分别为(29.28±3.04)%、(22.71±3.46)%、(9.32±2.27)%和(3.16±0.53)%,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。PR-M阴性中高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞增殖抑制率分别为(38.33±3.47)%、(33.42±4.15)%、(14.44±2.01)%和(4.14±0.65)%,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。PR-M阳性细胞增值抑制率小于PR-M阴性细胞增值抑制率,相同浓度组之间两两比较,差异有统计学意义(P0.05)。4.MIF作用于两组细胞干扰48h后,PR-M阳性高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞凋亡率分别为(44.63±4.69)%、(35.15±5.02)%、(18.74±2.45)%和(6.31±0.84)%,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。PR-M阴性中高浓度组、中浓度组、低浓度组和空白组细胞凋亡率分别为(63.44±6.84)%、(51.37±6.45)%、(25.61±3.14)%和(7.73±1.04)%,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。当MIF中浓度1×10~(-6)mol/L,PR-M阳性细胞凋亡率小于PR-M阴性细胞凋亡率,相同浓度组之间两两比较,差异有统计学意义(P0.05)。5.PR-M阳性组各组间Caspase3和Bcl-2蛋白表达量结果显示,促凋亡蛋白Caspase3表达量随着MIF浓度增高,蛋白表达量逐渐增大。抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量随着MIF作用浓度的增高,蛋白表达量逐渐降低。其中不同浓度各组间蛋白表达量与空白对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。结论1.子宫肌瘤的生长可能通过PR-M受体抑制细胞凋亡,起到促进细胞增值,而这种作用可能被孕激素受体抑制剂所抑制。2.PR-M通过调节增殖与凋亡参与子宫肌瘤的发生发展,其作用机制可能与上调促凋亡蛋白Caspase3及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达相关。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

相差显微镜,子宫肌瘤,状态,细胞

3 结果3.1 子宫肌瘤细胞原代培养结果及鉴定本实验通过缩短手术标本运送实验室的时间及消化之前的清洗处理，提高细胞提取率和细胞纯度及细胞数量，成功建立了 9 例子宫肌瘤体外细胞模型。倒置相差显微镜细胞形态观察: 细胞接种 24 小时即可贴壁，随后细胞逐渐增多、变长。生长良好的子宫肌瘤细胞呈长梭形或不规则，7 天左右细胞数量达高峰，并出现层叠排列及典型的“峰－谷”，通过免疫组化鉴定为子宫肌瘤细胞，平滑肌肌动蛋白（a-actin）阳性反应（见图 1）。

子宫肌瘤,乳腺癌细胞株,孕激素受体,阳性对照

3.3 实验分组实验分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、对照组，其中孕激素受体拮抗剂（MIF）浓度分别为 10-4,10-5,10-6mol/L,空白对照。处理时，对照组加入相同剂量的培养基。3.4 体外培养子宫肌瘤细胞生长曲线的绘制MTT 法通过细胞 OD 值得检测，生长曲线经过潜伏期，对数生长期，快速生长，经过 1 周生长进入平台期。从而绘制细胞生长曲线。呈“S”形状，见图 3

细胞生长曲线,子宫肌瘤,孕激素受体,对照组

3.3 实验分组实验分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、对照组，其中孕激素受体拮剂（MIF）浓度分别为 10-4,10-5,10-6mol/L,空白对照。处理时，对照组加入相剂量的培养基。3.4 体外培养子宫肌瘤细胞生长曲线的绘制MTT 法通过细胞 OD 值得检测，生长曲线经过潜伏期，对数生长期，快速长，经过 1 周生长进入平台期。从而绘制细胞生长曲线。呈“S”形状，见

【参考文献】