百里醌通过上皮—间质转化的诱导转录因子Twist1和Zeb1抑制宫颈癌细胞系CaSki和SiHa的侵袭转移

发布时间：2020-09-19 18:47

　　 目的:宫颈癌是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一,由于受到非特异性细胞毒性和耐药性影响,化疗应用受到限制。天然产物百里醌(Thymoquinone,TQ),在不同的癌症中,可作用于不同的信号传导途径,被认为是一种很有前途的抗癌分子。抑制上皮-间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)是一种重要的抗癌研究方向。在本研究中,百里醌被用于治疗宫颈癌细胞系CaSki和SiHa,从诱导细胞凋亡和抑制侵袭转移方面研究抗肿瘤药物百里醌对宫颈癌细胞的效应,观察不同浓度下百里醌对宫颈癌细胞生长的影响,研究对EMT调控蛋白和癌症转移的影响。研究百里醌用于治疗宫颈癌的机制和可能性,为宫颈癌的临床治疗提供新靶标、新思路。方法:(1)对宫颈癌细胞系CaSki和SiHa,用不同剂量(终浓度0μM/mL、1μM/mL、5μM/mL、10μM/mL、20μM/mL、40μM/mL)的百里醌,作用不同时间(12h、36h、24h和48h)后,应用CCK-8法检测百里醌对细胞的毒性作用。(2)用实时细胞分析仪检测百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用下,对宫颈癌细胞系CaSki和SiHa的生长、侵袭、迁移的影响。(3)流式细胞仪检测百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宫颈癌细胞系CaSki和SiHa后,对细胞凋亡率的影响。(4)实时荧光定量PCR检测百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宫颈癌细胞系CaSki和SiHa后,EMT分子以及凋亡相关不同基因mRNA转录水平的变化。(5)Western Blot检测百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、5μM/mL、10μM/mL)作用宫颈癌细胞系CaSki和SiHa后,不同EMT分子以及凋亡相关蛋白表达。(6)百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、1μM/mL、2μM/mL、4μM/mL、8μM/mL、16μM/mL)作用宫颈癌细胞系CaSki和SiHa后,用荧光素酶报告基因实验检测TQ是否作用于Twist1和Zeb1基因的启动子。(7)百里醌不同剂量(终浓度0μM/mL、5μM/mL)作用于宫颈癌细胞系CaSki和SiHa后,检测TQ对Twist1的启动子是否有甲基化作用。结果:(1)通过CCK-8检测,结果显示TQ剂量在5μM/mL或者较大剂量,作用时间在24h或者更长,对宫颈癌细胞系CaSki和SiHa有明显的细胞毒性作用,并呈剂量依赖性。(2)通过实时细胞功能分析仪检测,百里醌在5μM/mL或更大的剂量下可抑制宫颈癌细胞系CaSki和SiHa的生长、侵袭、转移过程。(3)流式细胞仪结果表明TQ可以增加宫颈癌细胞系CaSki和SiHa的细胞凋亡率。(4)实时荧光定量PCR检测,TQ不同剂量(终浓度5μM/mL和10μM/mL)作用24h后,宫颈癌细胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的mRNA转录水平降低,并且E-Cadherin的表达升高。在CaSki细胞系中,还影响了Vimentin和MMP-9,在SiHa细胞系还影响了Slug。Bax和Bcl-2在宫颈癌细胞系CaSki和SiHa中都没有明显变化。(5)Western blot结果显示,TQ不同剂量(终浓度5μM/mL和10μM/mL)作用36h后,宫颈癌细胞系CaSki和SiHa中Twist1,Zeb1的蛋白水平降低,而E-Cadherin的表达水平升高。但宫颈癌细胞系CaSki和SiHa中凋亡相关蛋白PARP,Caspase-3,Caspase-9的蛋白水平几乎没有变化。(6)荧光素酶报告基因实验分析表明百里醌分别减少了Twist1和Zeb1的启动子活性,并且RLU的减少与TQ剂量的增加存在依赖性,证明Twist1和Zeb1可能是百里醌的直接作用靶点。(7)通过百里醌处理(终浓度5μM/mL,24h)后的宫颈癌细胞系CaSki和SiHa,Twist1基因近端启动子进行甲基化后焦磷酸测序,数据分析有轻微增加。结论:我们的研究结果表明,百里醌除了明显抑制了宫颈癌细胞的增殖,还抑制了癌细胞的侵袭和转移。百里醌靶向作用于EMT-TFs,如Twist1和Zeb1,是抑制宫颈癌转移的可能机制。百里醌增加宫颈癌细胞的细胞凋亡率,但机制尚不明确。因此,百里醌可能是一种潜在的治疗宫颈癌的化疗药物,但对于百里醌发展和成为一种临床药物,仍需要进一步的基础和临床研究。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

1 CCK-8检测百里醌对宫颈癌细胞系CaSki和SiHa的细胞毒性作用。我们使用CCK-8来进行细胞毒性分析，表明百里醌对宫颈癌细胞CaSki和SiHa细胞的细胞毒性具有剂量依赖性(如表2 A&B，图2A&B)。在CaSki细胞中，经过12小时的百里醌处理后，它显示了剂量依赖效应，在24小时，36小时和48小时之后同样如此，各用药组与对照组相比较，差异有统计学意义(p<0.05)(如表2A,图2A)。然而在SiHa细胞中，百里醌处理12小时后，没有明显的影响，但是进行了24小时

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本文编号：2822867