miR-140-5p通过靶向调节VEGF影响人子宫内膜容受性的研究

发布时间：2020-09-24 17:47

　　目的子宫内膜容受性(endometrial receptivity,ER)是指子宫内膜处于一种允许囊胚定位、黏附、侵入并使内膜间质发生改变从而导致胚胎着床的状态。这个过程需要多种精密而复杂的调控机制。辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)不断进步和完善使得临床妊娠率有了较大的提高,但是子宫内膜容受性降低仍旧是阻碍胚胎着床,影响妊娠率的重要原因。子宫内膜容受性的影响因素有许多,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在许多物种的早期妊娠中起关键作用,并且VEGF水平的改变会严重影响囊胚植入率。研究VEGF在子宫内膜中的调控作用有助于发现其潜在分子标志物和有效的改善方法。本文检测了反复种植失败患者子宫内膜中miR-140-5p和VEGF的表达水平,并构建人子宫内膜上皮细胞株,通过研究对孕酮/miR-140-5p/VEGF的表达水平检测和细胞功能学分析,明确了该信号轴对人子宫内膜上皮细胞的功能学效应,揭示了miR-140-5p作为子宫内膜容受性标志分子在提高妊娠率上的潜在应用价值,为改善子宫内膜容受性提供了潜在靶点。方法1.VEGF在反复种植失败患者子宫内膜中的表达及其对人子宫内膜上皮细胞的影响收集20例经体外受精-胚胎移植反复种植失败患者和20例自然周期复苏移植成功妊娠患者的子宫内膜组织样本,采用western blotting及qRT-PCR方法检测VEGF的表达水平。通过CCK-8法、克隆形成实验检测VEGF异常表达对人子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cell,EEC)功能的影响。采用western blotting方法检测人反复种植失败患者子宫内膜及VEGF异常表达的EEC中LIF的表达水平。采用qRT-PCR、western blotting方法和流式细胞仪检测VEGF异常表达时,细胞周期相关因子CCNB1、CCND1、和CDK2的水平变化和对细胞周期的影响。2.miR-140-5p通过靶向调节VEGF表达影响人子宫内膜上皮细胞的增殖我们通过在线数据库预测可以靶向调控VEGF的miRNAs,重点关注miR-140-5p,采用荧光素酶报告基因检测验证了miR-140-5p和VEGF之间的靶向关系。采用qRT-PCR检测20例经体外受精-胚胎移植反复种植失败患者和20例自然周期复苏移植成功妊娠患者的子宫内膜组织中miR-140-5p的表达水平。采用qRT-PCR和western blotting方法检测了miR-140-5p异常表达对VEGF表达的影响。采用CCK-8法和克隆形成实验检测了miR-140-5p异常表达对EEC活性的影响。3.孕酮对人子宫内膜上皮细胞的影响采用不同浓度(0、1、5和10 nmol/L)的孕酮处理EEC,再采用10nmol/L孕酮处理EEC12、24和36小时,通过CCK-8法及克隆形成实验检测EEC的活性。并通过qRT-PCR检测孕酮10 nmol/L处理EEC24小时后,miR-140-5p和VEGF mRNA的表达水平。结果1.VEGF在反复种植失败患者子宫内膜中的表达及其对人子宫内膜上皮细胞的影响反复体外受精-胚胎移植失败患者子宫内膜组织中VEGF表达显著性降低(P0.001)。VEGF可促进了EEC的增殖,而抑制VEGF的表达则抑制EEC的生长。与对照组相比,反复种植失败患者子宫内膜中的LIF蛋白表达水平降低。VEGF过表达时EEC中LIF蛋白水平增高,而VEGF抑制表达时,LIF蛋白表达水平降低。VEGF过表达显著地促进了细胞周期相关调控因子CCNB1、CCND1、和CDK2的mRNA和蛋白表达水平(P0.01或P0.05),而VEGF抑制则降低了这三种调控因子的mRNA和蛋白表达水平(P0.05)。2.miR-140-5p通过靶向调节VEGF表达影响人子宫内膜上皮细胞的增殖在反复体外受精-胚胎移植失败患者子宫内膜组织中,miR-140-5p表达上调。VEGF是miR-140-5p的靶基因。过表达miR-140-5p可以抑制野生型VEGF3'-UTR的荧光素酶活性,而对突变型VEGF 3'-UTR偶联的荧光素酶活性无显著抑制效果。在EEC细胞中过表达miR-140-5p能显著抑制细胞的增殖;而抑制miR-140-5p表达则显著性的促进了细胞的增殖(P0.05)。同时,过表达miR-140-5p也显著地抑制了VEGF mRNA和蛋白的表达水平(P0.05),而miR-140-5p和VEGF mRNA同时过表达则结果出现了反转。结果显示,miR-140-5p诱导的VEGF mRNA表达显示了上调同时促进了细胞的活性(P0.01)。3.孕酮对人子宫内膜上皮细胞的影响孕酮显著地促进了EEC的活性,呈剂量及时间依赖性(P0.05,P0.01或P0.001)。孕酮处理的EEC克隆形成明显增多(P0.01)。孕酮显著地抑制了EEC中miR-140-5p的表达,促进了VEGF mRNA的表达(P0.05,P0.01)。结论1.VEGF在反复体外受精-胚胎移植失败患者的子宫内膜组织中低表达。VEGF可促进EEC的增殖和细胞周期。反复种植失败患者子宫内膜组织和EEC中LIF的表达水平与VEGF具有一致性。2.miR-140-5p在反复体外受精-胚胎移植失败患者的子宫内膜组织中高表达,VEGF是miR-140-5p靶基因,miR-140-5p可通过靶向VEGF抑制EEC的增殖。3.孕酮可显著抑制miR-140-5p,促进VEGF的表达,同时促进EEC的增殖。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714.8
【部分图文】：

子宫内膜,患者,子宫内膜组织,表达水平

1.4.2 反复种植失败患者子宫内膜中 VEGF 异常表达采用 qRT-PCR 和 western blotting 检测对照组和反复种植失败患者组子宫内膜组织中 VEGF 的表达水平。结果显示，与能够获得妊娠的正常子宫内膜组织相比，反复种植失败患者子宫内膜组织中 VEGF 蛋白量显著性降低（P < 0.001，图 1.1 A，仅展示四对典型图，n=3），同时，qRT-PCR 结果表明，在反复种植失败患者子宫内膜组织中，VEGF mRNA 表达水平也下调（图 1.1 B）。以上结果表明，反复种植失败患者子宫内膜中 VEGF 异常低表达（P < 0.001）。

过表达,克隆形成,转染效率,内细胞

22 VEGF 过表达促进 EEC 的增殖，敲低 VEGF 抑制 EEC 的增殖。（A）采用 qRT-n blotting 检测 pcDNA3.1-VEGF 和 si-VEGF 的转染效率。（B）CCK-8 法检测内细胞的增殖能力。（C）克隆形成实验检测 VEGF 对 EEC 克隆形成能力的 1.2 Overexpression of VEGF promotes the proliferation of EEC. Knockdown os the proliferation of EEC (A) The transfection efficiency of pcDNA3.1-VEF were examined by qRT-PCR and Western blotting . (B) The cell proliferation abred in 96 h after transfection. (C) Overexpression of VEGF imporved the cloningdown of VEGF inhibited the cloning of EEC.

子宫内膜,表达水平,过表达,患者

.4 反复种植失败患者子宫内膜及 EEC 中 LIF 的异常表达LIF 的表达水平可用于评估不同年龄女性的子宫内膜功能[55]。因此，用 VEGF 异常表达时对子宫内膜容中 LIF 表达水平的影响，评估子宫内膜。我们采用了 Western blotting 方法检测反复种植患者的子宫内膜组织中表达水平，结果显示，与正常人子宫内膜上皮细胞相比，反复种植患者膜组织中 LIF 蛋白表达减低（P < 0.01，图 1.3 A n = 3）。进一步DNA3.1-VEGF（VEGF 过表达）、si-VEGF（VEGF 低表达）以及其相应对照转染的 EEC 中，Western blotting 检测 LIF 的表达水平。结果显示，si-V染的细胞中，LIF 蛋白表达降低；相反，pcDNA3.1-VEGF 转染的细胞中，白表达升高（P < 0.01，图 1.3 B，n = 3）。总的来说，VEGF 的表达水F 的表达水平具有一致性。

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