乙型肝炎病毒HBx蛋白对人精子功能及胚胎发育影响的研究

发布时间：2020-09-26 20:14

　　背景和目的乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒感染所引起的传染性疾病,我国是乙型肝炎的高发地区。乙型肝炎病毒能够穿过血睾屏障,并能进入精子细胞核中整合在染色质上,因此病毒可以通过生殖细胞进行垂直传播。HBV感染伴随着大量表观遗传学的修饰改变,但其影响精子质量的发病机制目前尚未完全阐明。随着辅助生殖技术的进步,卵子受精时对精子质量的要求大大降低,但父源HBV病毒是否通过精子能影响胚胎的发育以及其影响机制,有待进一步阐明。研究HBV对人精子功能影响是乙肝病毒感染分子生物学和生殖医学的交叉领域,研究精子组蛋白表观遗传修饰对精子及对胚胎发育的影响,有助进一步明确HBV导致男性生育力改变的原因。也为研发提高男性生育力的治疗及阻断乙肝病毒垂直传播提供理论依据。研究方法回顾性分析2014年1月至2016年1月至我院生殖中心行辅助生殖技术治疗(IVF/ICSI)的配偶2359对。按是否感染HBV进行分组分析男方的精液质量及子代胚胎的发育情况;收集HBV患者精液样本,利用表达谱芯片初步探讨HBV感染者对男性精子的影响,筛选差异表达基因进行分析;筛选出差异表达基因H3K9me3,用免疫共沉淀技术筛选与H3K9me3及HBx在精子中相关的蛋白,采用RTqRCP、western-blot验证芯片分析结果;采用慢病毒转染技术构建Hbx稳定表达鼠精原细胞,用细胞周期实验、凋亡实验、小RNA干扰表达等多个实验对HBx蛋白影响精细胞的机制进行探讨;动物实验探讨HBx蛋白对胚胎的发育的影响。采集小鼠卵及精子进行转染及其甲基化水平进行分析,观测其表达及对胚胎发育的影响。结果乙肝表面抗原阳性的男性患者精子浓度、精子总数、PR率、精子存活率较低,畸型精子率更高;父系乙肝病毒感染影响ICSI结局、正常受精率、优胚率低于抗原阴性组;乙肝病毒高拷贝数使精子质量和优胚率下降;在HBV患者精子中存在多种差异表达基因,包括H3K9me3、组蛋白甲基转移酶(Suv39H1)、DNA甲基转移酶、HBx蛋白。其功能涉及组蛋白修饰、精子发生、细胞分化、染色质形成;进一步研究发现Hbx在精子中能引起Suv39H1的下调,从而引起组蛋白H3K9me3的下降、导致精子组蛋白替换异常、精子DNA损伤、精原细胞细胞周期停滞、凋亡增加。HBx的表达可能受UBP1的调控,HBx能与E2F5共同作用抑制Suv39H1的表达。动物实验显示转染HBx后精子高表达H19、KCNQ1OT1,低表达IGF2。在体外培养系统中,小鼠精子转染HBx后未见对植入前胚胎的发育产生影响。结论HBV感染患者能在精原细胞表达HBx蛋白,通过HBx蛋白使精子组蛋白替换异常、精子DNA损伤、细胞分裂减慢、凋亡增加,精子的数量和质量下降。在动物实验中HBx能影响部分印迹基因控制区域甲基化水平。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R714.8;R512.62
【部分图文】：

散点图,热图,聚类分析,相关性

图 2-1 样品相关性聚类分析热图2.2 散点图特征分析本研究中表达差异基因数据，将其数值转化为 log 以 2 为底的对数后，在一个二维直角坐标系平面中，绘制成图 2-2 所示的散点图。图中可见，每一个点代表芯片上的某一个基因探针的表达量。该点在散点图中的分布位置由其 X 轴坐标和 Y轴坐标确定：X 轴代表该基因在乙肝阳性组中换算后的表达量。Y 轴代表该基因在非乙肝对照组中换算以后的表达量。红色点表示 1.5 倍上调基因共 1239 个，绿色点表示 1.5 倍下调基因共 1161 个，无差异基因 29581 个。散点图的相关系数为 0.9723，相关性较好。

散点图,散点图,红色区域,差异表达

图 2-2 差异基因散点图征分析于反映具备差异表达的基因的数目及其分布情况。图 2)值，即由 t-检验计算所得的 P-value 值的以 10 为底的对数2 (Fold Change)，即两组样本间的差异倍数的以 2 为底的表达的上调或下调。红色区域代表 P-value <0.05，Fold基因，即表达量显著差异共 214 个，绿色区域代表 P-val0 的有差异的下调基因，即表达量显著差异共 86 个，无681 个。

火山,基因,染色体

图 2-3 差异基因的火山图因染色体分布一步了解差异基因的功能，采用 genome browser 和 RNAplex，找染色体的位置，统计所有差异基因在染色体的分布位点，绘制标为基因数目，横坐标为染色体位置，深色的柱子为上调基因的基因。图中可见，显著上调的基因主要分布在 1 号、3 号、5体上，显著下调的基因主要分布在 2 号、11 号、22 号染色体上最多显著差异基因。

【参考文献】