研究背景：卵巢癌是女性系统三大恶性肿瘤之一,其中上皮性卵巢癌是最常见的组织学类型,占卵巢恶性肿瘤的85%-90%。由于卵巢位于盆腔深部,发病隐匿,早期症状不典型,缺乏有效的早期诊断方法,临床初诊患者70-80%己属中晚期。近年来,虽然肿瘤细胞减灭术和各种化疗方法有了迅速发展,但其5年生存率无明显改善,仍徘徊在30-40%,已经成为严重威胁妇女健康的主要肿瘤,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。因此,研究卵巢癌发病的分子生物学机制,从分子水平揭示上皮性卵巢癌的发生、发展过程,研发早期诊断技术以及探索新的药物治疗靶点是目前的研究热点。近年来,随着表观遗传学的发展,人们逐步认识到表观遗传学的改变和遗传学的改变一样共同参与了肿瘤的发生、发展,肿瘤不仅是遗传学疾病,同时也是表观遗传学疾病。DNA甲基化作为表观遗传学的主要修饰形式,是在甲基转移酶的催化下,甲基被动的增添在胞嘧啶上,生成5-甲基胞嘧啶的过程,是目前表观遗传学中研究最多、最深入的领域。DNA的异常甲基化和肿瘤的发生发展密切相关,而且是肿瘤中的早期、频发事件。研究证实基因启动子区高甲基化是肿瘤抑制基因失活的重要机制,在某些情况下甚至是抑癌基因失活的唯一机制。恶性肿瘤患者外周血中游离DNA含量明显高于正常健康人,而且具备与原发肿瘤组织一致的恶性细胞生物学行为,因此分析外周血中游离DNA的甲基化状态,可以反映实体肿瘤的甲基化水平,对于恶性肿瘤的早期诊断极具临床应用价值,可作为一种潜在的无创性肿瘤标志物。DNA甲基化具有可逆性,甲基转移酶抑制剂可以逆转抑癌基因的高甲基化状态,使之重新表达,从而达到抑制肿瘤生长的目的,是目前肿瘤基因治疗的研究热点。5-氮杂2’-脱氧胞苷(5-aza-dC)是目前最为常见的核苷类甲基转移酶抑制剂,能够有效抑制肿瘤细胞的生长及侵袭。Ras通过和不同的效应分子结合来调节不同的生命活动,既能促进肿瘤的发生,又能抑制生长,如促进凋亡,细胞周期阻滞等。Ras的负效应调节因子参与了Ras的生长抑制作用,其中研究最多的是RASSF家族。目前为止,共发现这个家族有10个成员(RASSF1-10)。大量研究已证实RASSF1A启动子区超甲基化介导的基因转录失活是肿瘤癌变过程中的频发事件,其参与了包括卵巢癌在内的多种实性肿瘤的发生、发展过程,是上皮性卵巢癌中最常见的甲基化抑癌基因,可作为卵巢癌诊治过程中有意义的分子生物学指标。与RASSF 1A具有高度同源性的RASSF2A在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌中表达降低或缺失与其甲基化有关。RASSF2A基因作为Ras的下游效应物,在Ras激活信号转导通路中发挥重要的负向调节作用,扮演抑癌基因的角色。但有关RASSF2A基因与卵巢癌的关系尚无文献报道。本实验采用甲基化特异性PCR检测上皮性卵巢癌组织及其相对应的血清标本中RASSF2A基因启动子甲基化状态,RT-PCR检测RASSF2A mRNA在卵巢癌组织中的表达情况,分析RASSF2A启动子异常甲基化与其转录表达的相关性,甲基化状态在两种组织标本中的相关性,以及RASSF2A启动子甲基化与卵巢癌患者临床病理特征(年龄、病理类型、临床分期、组织分级、淋巴转移)的关系。并使用去甲基化试剂5-aza-dC作用于卵巢癌细胞系SKOV3,分析去甲基化作用前后RASSF2A表达水平、甲基化状态的改变,以及对细胞生物学活性的影响,探讨RASSF2A启动子区甲基化在卵巢癌发生发展中的作用及机制,血清RASSF2A启动子区甲基化状态在卵巢癌早期诊断中的价值,初步探索并寻找治疗卵巢癌的新靶点。第一部分卵巢癌组织中RASSF2A基因转录表达及其甲基化状态的检测目的：检测上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中RASSF2A基因启动子区甲基化状态及其nRNA表达情况,分析RASSF2A基因启动子异常甲基化与转录表达的相关性,及其与卵巢癌患者年龄、病理类型、临床分期、组织分级、淋巴转移等临床病理特征的关系,初步探讨RASSF2A基因启动子区CpG岛高甲基化水平与其表达缺失之间的关系,研究RASSF2A基因在上皮性卵巢癌中的作用机制。方法：本研究采用RT-PCR方法检测上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中RASSF2A基因mRNA表达情况,同时采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)方法检测不同组织中RASSF2A基因启动子区甲基化状态。结果：1.RASSF2AmRNA在三组卵巢组织中的表达RASSF?AmRNA在正常卵巢及良性卵巢肿瘤组织中的阳性表达率分别为90%(9/10)、85.7%(12/14),而在卵巢癌组织中RASSF2A的表达率明显下降,仅为42.6%(20/47)。三组中RASSF2A mRNA的表达存在显著性差异(x2=13.198,p=0.001)。三组中两两比较,卵巢癌组与良性卵巢肿瘤组,卵巢癌组与正常卵巢组差异均有统计学意义(x2=8.057,p=0.005；x2=7.427,p=0.006),良性卵巢肿瘤组与正常卵巢组比较,差异无统计学意义(x2=0.098,p=0.754)。2.三组卵巢组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态卵巢癌组织中有51.1%(24/47)的组织存在RASSF2A甲基化,而在良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中均未检测到此现象。卵巢癌组织中RASSF2A甲基化阳性率明显高于良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织(x2=18.513,p=0.001),差异具有显著性。3.RASSF2A启动子甲基化与基因表达及卵巢癌的关系在卵巢癌组织中,RASSF2A甲基化阴性的组织中其mRNA的表达率较高,为82.6%(19/23),而在RASSF2A甲基化阳性的组织中其mRNA的表达明显下降,仅为33.3%(8/24),差异具有显著性(x2=11.665,r=-0.498,p=0.001)。RASSF2A甲基化程度与卵巢癌患者的年龄、病理类型、临床分期、组织分级、淋巴转移之间无明显的相关性。但随着患者年龄的增加,RASSF2A甲基化有升高趋势。结论：1.RASSF2AmRNA在卵巢癌组织中的表达明显低于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织,呈低表达或表达缺失。2. RASSF2A启动子区高甲基化是卵巢癌中的频发事件,是卵巢癌中作为抑癌基因的RASSF2A失活的重要原因之一。3. RASSF2A启动子区高甲基化导致的基因转录沉默在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用。第二部分卵巢癌患者血清标本中RASSF2A基因甲基化水平及临床意义目的：检测上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织相配对的血清标本中RASSF2A基因启动子区甲基化状态,并分析其与卵巢癌患者年龄、病理类型、临床分期、组织分级、淋巴转移等临床病理参数的关系,初步探讨检测血清RASSF2A启动子区甲基化状态在卵巢癌诊断中的作用。方法：本研究采用MSP方法检测第一部分实验中卵巢组织相对应的血清标本中RASSF2A基因启动子区甲基化状态。结果：1.三组血清标本中RASSF2A启动子区甲基化状态卵巢癌组血清中36.2%(17/47)的标本存在RASSF2A甲基化,而在良性卵巢肿瘤组及正常卵巢组中均未检测到此现象。卵巢癌组血清标本RASSF2A甲基化阳性率明显高于良性卵巢肿瘤组、正常卵巢组(x2=11.414,p=0.003),差异具有显著性。2. RASSF2A启动子区甲基化状态在血清标本与组织标本中的关系结合第一部分实验结果,在发生RASSF2A甲基化的24例组织标本中,其对应的血清标本中有17例亦发生了甲基化；在未发生基因甲基化的23例组织标本中,其对应的血清标本也未发现甲基化现象。两者有明显的相关性,差异具有显著性(x2=25.524,r=0.737,p=0.000)。3.血清标本中RASSF2A甲基化水平与临床特征的关系血清标本中RASSF2A甲基化程度与卵巢癌患者的临床病理特征之间无明显的相关性。结论：1.血清标本中RASSF2A启动子区甲基化具有肿瘤特异性,是卵巢癌中的早期、频发事件。2.血清标本中RASSF2A启动子区甲基化状态可以间接反应原发肿瘤DNA甲基化水平,是原发肿瘤的有效参考指标。3.检测血清标本中RASSF2A启动子区甲基化水平可作为卵巢癌的表观遗传学标记物,有助于卵巢癌的早期诊断。第三部分5-aza-dC对卵巢癌细胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化及其表达的影响目的：本研究使用去甲基化试剂5-aza-dC作用于卵巢癌细胞系SKOV3,分析去甲基化作用前后RASSF2A基因甲基化及其表达水平的改变,以及SKOV3细胞生物学功能的影响,初步探讨并寻找治疗卵巢癌的新靶点。方法：本研究采用RT-PCR方法检测5-aza-dC作用前后卵巢癌细胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表达水平；MSP方法检测其甲基化状态的改变；MTT和流式细胞术检测药物对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果：1.去甲基化试剂对SKOV3中RASSF2A基因表达的影响5-aza-dC作用后使卵巢癌细胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表达水平明显增高。2.去甲基化试剂对SKOV3中RASSF2A启动子甲基化的影响5-aza-dC作用后使卵巢癌细胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化水平下降。3.去甲基化试剂对卵巢癌细胞生物学行为的影响5-aza-dC药物干预后,SKOV3细胞活性和抗凋亡能力均明显下降。结论：1.去甲基化试剂5-aza-dC可使RASSF2A表达升高或重新表达,提示基因甲基化是导致卵巢癌细胞中RASSF2A低表达或表达缺失的原因之一。2.去甲基化试剂5-aza-dC可以逆转卵巢癌细胞中RASSF2A基因甲基化状态,提高其mRNA的表达,为卵巢癌的临床治疗提供新的分子靶点。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R737.31
【文章目录】：中文摘要
ABSTRACT
符号说明
第一部分
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
第一部分相关图表
参考文献
第二部分
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
第二部分相关图表
参考文献
第三部分
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
第三部分附图表
参考文献
致谢
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本文编号：
2835277
