TRPM7通过调控上皮间质转化影响卵巢癌细胞侵袭转移的机制研究

发布时间：2020-10-16 12:58

　　 目的:我们前期发现TRPM7(Transient receptor potential melastatin 7)可促进上皮性卵巢癌细胞侵袭迁移,但其机制尚未阐明。本研究旨在探讨TRPM7通过[Ca~(2+)]i-PI3K/AKT信号轴调控上皮性卵巢癌细胞EMT,进而影响上皮性卵巢癌侵袭转移的作用与分子机制,为上皮性卵巢癌抗转移治疗提供新的分子靶标和新策略。方法:本研究分别在SKOV3及OVCAR3中建立稳定沉默TRPM7表达的上皮性卵巢癌细胞系,采用划痕、Transwell侵袭迁移实验、尾静脉注射裸鼠肺转移瘤实验等方法在体内外考察TRPM7对上皮性卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响,通过形态学观察、流式细胞分析术、Western Blot、qRT-PCR等方法考察TRPM7表达改变,或同时抑制胞内钙信号,或给予PI3K/AKT激活剂/抑制剂处理对上皮性卵巢癌细胞EMT相关标志物及钙信号的影响,以及PI3K/AKT信号通路分子表达的影响。结果:1.本研究成功构建了TRPM7稳定沉默的上皮性卵巢癌细胞株。体内、体外显示沉默TRPM7表达后,上皮性卵巢癌细胞的侵袭转移能力明显减弱、EMT改变显著被抑制;使用Fluo-8-AM标记钙离子,激光共聚焦及流式细胞检测技术发现,沉默TRPM7表达可明显减弱细胞内的钙信号。2.本研究使用激光共聚焦及流式细胞检测技术发现钙离子螯合剂BAPTA-AM可以有效阻断SKOV3及OVCAR3细胞内的钙信号,并抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移。SKOV3及OVCAR3细胞给予BAPTA-AM处理的同时,分别激活或抑制PI3K/AKT信号通路,侵袭迁移实验结果显示抑制(激活)PI3K/AKT信号通路对其分别具有增强(抵消)作用,提示钙信号可以通过PI3K/AKT通路影响上皮性卵巢癌细胞侵袭转移。3.本研究通过BAPTA-AM阻断TRPM7稳定沉默的上皮性卵巢癌细胞中的钙信号,增强TRPM7沉默对上皮性卵巢癌细胞侵袭迁移的抑制作用。4.体内、体外实验显示沉默TRPM7表达可以通过[Ca~(2+)]i影响PI3K介导Akt磷酸化,进而抑制上皮性卵巢癌细胞EMT。结论:1.[Ca~(2+)]i可通过激活PI3K/AKT通路促进上皮性卵巢癌细胞EMT、侵袭转移。2.沉默TRPM7可通过抑制[Ca~(2+)]i-PI3K/AKT信号通路介导的EMT,进而抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

图 1.1 TRPM7 结构，同肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移有关既往的研究表明，TRPM7 在上皮性卵巢癌组织及细胞中性卵巢癌组织中，其表达水平与上皮性卵巢癌患者盆腔淋正相关[18,19]。因此，本研究将从体内及体外实验探究“T平来激活 PI3K / AKT 信号传导，进而调节上皮性卵巢癌皮性卵巢癌的侵袭与转移”的作用。本研究目的为探索：癌细胞[Ca2+]i、EMT 及侵袭转移的作用；2.钙信号与上皮袭转移能力的关系；3.TRPM7 通过钙信号介导上皮性卵移的机制探索。本研究旨在为上皮性卵巢癌的侵袭转移的思路和策略。

南华大学硕士学位论文30图3.1 稳定干扰TRPM7上皮性卵巢癌细胞系验证（A）Western blot 实验（以GAPDH作为内参）分析TRPM7在正常卵巢上皮和EOC细胞中的蛋白表达水平；（B）QRT-PCR实验（以GAPDH作为内参）分析TRPM7在稳转SKOV3和OVCAR3细胞中mRNA表达下降水平；（C） Western blot 实验（以GAPDH作为内参）分析TRPM7在稳转SKOV3和OVCAR3细胞中蛋白表达下降水平。（所有数据均来自3次独立重复试验，结果均用均值±标准差（SD）表示，组间采用t检验）3.1.2 沉默 TRPM7 对上皮性卵巢癌细胞迁移能力的影响本研究通过Transwell迁移实验观察沉默TRPM7表达后上皮性卵巢癌细胞迁移能力的变化。细胞迁移实验结果发现：在SKOV3细胞中， sh-control-SKOV3组48h后穿过小室膜到达下室面的细胞个数为176±12.64、而sh-TRPM7-SKOV3组穿过的细胞数明显减少，为30±11.42，差异有统计学意义（P<0.05）；在OVCAR3细胞中，得到了相类似的结果，即sh-control-OVCAR3组穿膜细胞数为163±10.21、sh-TRPM7-OVCAR3组为50±10.17，sh-TRPM7-OVCAR3组穿膜细胞数明显减少

细胞实验结果与前者类似，即sh-control-OVCAR3和sh-TRPM7-OVCAR3划痕48h后细胞迁移率分别为60.32±3.51%和30.34±4.14%，差异有统计学意义（P<0.05）。以上结果同样说明，沉默TRPM7可抑制上皮性卵巢癌上皮细胞迁移（图3.2B）。图3.2 沉默TRPM7表达对上皮性卵巢癌细胞迁移能力的影响在上皮性卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞中沉默TRPM7后，行（A）Transwell迁移实验；（B）划痕实验。（所有数据均来自3次独立重复试验，结果均用均值±标准差（SD）表示，组间采用t检验）3.1.3 沉默 TRPM7 对上皮性卵巢癌细胞侵袭能力的影响本研究通过Transwell侵袭实验观察沉默TRPM7表达对上皮性卵巢癌细胞侵袭 能 力 的 影 响 。 结 果 发 现 ： 在 SKOV3 细 胞 中 sh-control-SKOV3 及sh-TRPM7-SKOV348h后穿过基质胶及小室膜到达下室面的细胞个数分别是：183±11.34、32±12.12，即干扰组明显少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；在OVCAR3细胞中也发现，sh-control-OVCAR348h后穿过基质胶及小室膜到达下室面的细胞个数是156±11.12，sh-TRPM7- OVCAR3数目明显减少，为20±12.13
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本文编号：2843288