研究背景:子宫内膜癌是妇科恶性肿瘤常见的死亡原因之一,子宫内膜癌根据其分子和临床特征分为两类。其中,80-90%的子宫内膜癌属于Ⅰ型,包括常见的子宫内膜样腺癌,多发于绝经前妇女,与暴露于过量的雌激素中相关。通常可早期诊断,预后良好。与此相反,Ⅱ型子宫内膜癌,约占10-20%,大多数为浆液性,发生于老年妇女的萎缩性子宫内膜,不依赖于激素。这种组织学亚型的患者的临床过程远比Ⅰ型癌症要恶性程度高,即使是被诊断为早期疾病的少数人。对于Ⅱ型癌症或Ⅰ型晚期子宫内膜癌患者的主要治疗方案包括化疗。顺铂是临床最常见的治疗癌症的化疗药物,抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药有协同作用。但其耐药性是导致其治疗失败的主要原因。多药耐药是化疗中的一个主要问题,30-80%的癌症患者对化疗药物产生耐药性。因此,对抗耐药性对于提供最佳治疗至关重要。在诸多肿瘤多药耐药作用机制中,ATP驱动的结构及功能上的跨膜转运的多为非特异性的细胞抑制剂,从而限制其在细胞内达到治疗浓度。ATP结合盒(ABC)超家族成员中的膜转运子在肿瘤细胞中过度表达,也是已知的通过ATP依赖性药物外排机制的MDR调节因子,包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)及乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。各种引起耐药性的原因可以同时起作用,以多因素方式增加耐药性。细胞内许多具有氧化活性的物质,如活性氧(ROS),是生物在有氧环境的代谢产物。研究显示ROS在诸如细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥信号传导作用。研究发现ROS在肿瘤发生和发展过程中发挥了重要作用。ROS对DNA和蛋白质的损害是肿瘤发生和发展的主要原因之一。ROS对DNA和蛋白质的损害可以表现为损伤抑癌基因、激活原癌基因,从而诱导细胞的恶性转化。因此,ROS是潜在的致癌物质。另一方面,肿瘤细胞经常显示ROS水平明显增高。氧化应激是细胞内ROS过度产生和/或细胞抗氧化防御系统功能受损造成的细胞状态。肿瘤细胞氧化应激的增强能增加DNA和蛋白质的异常及肿瘤细胞的血液供应,加速肿瘤的发展和转移,加强肿瘤细胞对化疗药物的抵抗。大黄素(Emodin)是中药大黄的主要有效成分之一,是一种酪氨酸激酶抑制剂,现代药理研究发现Emodin不仅具有抗炎、抗癌的作用,同时能够抑制不同系统肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,控制肿瘤细胞的转移,协同其他化疗药物的抗癌作用,同时改变了肿瘤细胞的周围环境,减少营养物质的摄取,破坏细胞膜,从而达到促使肿瘤细胞死亡的结果。Emodin与现临床上使用的抗肿瘤药物及放化疗等均具有较好的协同作用,鉴于Emodin具有抗肿瘤作用且毒性较低,因此,Emodin是应用于临床肿瘤治疗的潜在有效药物。本研究首次探究了 Emodin单独或者联合顺铂对两型子宫内膜癌细胞是否具有抗肿瘤效应以及该药物是否增强顺铂的化疗作用及其机制,并在荷瘤裸鼠的体内实验中进一步证实,为子宫内膜癌替代治疗药物的研发提供新思路。第一部分:Emodin对子宫内膜癌细胞的抗肿瘤效应及细胞内ROS水平和耐药基因表达的影响研究目的:1.检测Emodin在顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞生长和凋亡中的作用;2.检测Emodin和顺铂单独或者联合应用后,子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平的变化;3.探究Emodin在子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中对耐药基因表达的影响。研究方法:应用CCK-8试剂盒检测Emodin和顺铂不同浓度梯度作用于两种子宫内膜癌细胞(Ishikawa细胞和HEC-IB细胞)的生长抑制率,并计算出两种药物的IC50浓度;用IC50浓度的Emodin及顺铂单独及联合作用于Ishikawa细胞和HEC-IB细胞,应用CCK-8试剂盒检测细胞的生长增殖情况。应用Annexin V/propidide双染色法检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡水平,并通过Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平。通过DCFH-DA法检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平,并通过Western blot检测NADPH氧化酶的表达水平。通过DCFH-DA法检测H_2O_2预处理后的Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平的变化。通过实时RT-PCR检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因Pgp、MRP1及BCRP的表达,并通过Western blot检测耐药基因Pgp、MRP1及BCRP蛋白的表达。通过实时RT-PCR检测H_2O_2预处理后的Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因Pgp、MRP1及BCRP的表达。通过实时RT-PCR检测siRNA转染前后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因Pgp、MRP1及BCRP的表达变化,并通过Annexin V/propidide双染色法检测siRNA转染后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡水平。研究结果:1.Emodin和顺铂作用于Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的生长抑制作用及增殖能力的影响:应用CCK-8试剂盒检测Emodin和顺铂不同浓度梯度作用于Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的生长抑制作用。结果显示:Emodin和顺铂明显抑制了细胞的生长,并得出Emodin半抑制浓度IC50浓度为10 μmol/L,顺铂并得出Emodin IC50浓度为10 μmol/L,顺铂IC50浓度为1μg/mL。IC50浓度为1μ g/mL。应用CCK-8试剂盒检测IC50浓度的Emodin及顺铂单独及联合作用后的细胞增殖率,结果显示:Emodin及顺铂单独及联合作用明显抑制了 Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的增殖水平,这种抑制作用具有时间依赖性,并且两种药物联合应用时抑制作用尤为显著,尤其对Ishikawa细胞的抑制作用更为明显。2.Emodin和顺铂对于Ishikawa细胞和HEC-IB细胞凋亡的影响:应用Annexin V/propidide双染色法检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡水平的影响。结果显示:Emodin和顺铂明显促进Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡,两种药物联合应用时尤其显著。并通过Western blot检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平,结果显示:caspase-3的表达水平明显升高,两药联用时升高更加显著。并且联合应用对于Ishikawa细胞的凋亡作用更加显著。3.Emodin和顺铂可降低子宫内膜癌细胞中ROS水平:通过DCFH-DA法检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平的影响,结果显示:Emodin及顺铂降低了 Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平,两药联用时作用更加显著。并通过Western blot检测NADPH氧化酶的表达水平,结果显示:Emmodin及顺铂联合应用显著抑制NADPH氧化酶的表达。两种细胞之间无明显差异。4.H_2O_2对Emodin和顺铂作用后的子宫内膜癌细胞内的ROS水平的影响:通过DCFH-DA法检测H_2O_2预处理后的Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平的变化,结果显示:H_2O_2处理后,之前Emodin与顺铂联合应用导致的ROS水平的下降,又表现为升高。两种细胞之间无明显差异。5.Emodin和顺铂对子宫内膜癌细胞的耐药基因表达的影响:通过实时RT-PCR检测Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因P-gp、MRP1及BCRP的表达,并通过Western blot检测耐药基因P-gp、MRP1及BCRP蛋白的表达,结果显示:耐药基因P-gp、MRP1及BCRP的表达及其蛋白的表达均明显下降,两药联用时尤其显著,并且联合处理对Ishikawa细胞中P-gp和BCRP蛋白水平的抑制作用更为明显。6.H_2O_2作用后的子宫内膜癌细胞内耐药基因表达的影响:通过RT-PCR检测H_2O_2预处理后的Emodin及顺铂单独及两药联合应用后Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因P-gp、MRP1及BCRP的表达,结果显示:两种细胞中耐药基因P-gp、MRP1及BCRP的表达均较前升高。这提示我们子宫内膜癌细胞内耐药基因的表达水平可能与ROS水平相关。7.抑制耐药基因的表达对子宫内膜癌细胞的凋亡的影响:通过siRNA转染Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因P-gp、MRP1及BCRP,RT-PCR检测基因水平变化,结果显示:耐药基因P-gp、MRP1及BCRP水平均较转染前明显下降。通过Annexin V/propidide双染色法检测siRNA转染基因后Emodin作用的Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡水平,结果显示:即使不联合使用顺铂,基因的表达下调也能显著提高Ishikawa细胞和HEC-IB细胞的凋亡水平。研究结论:1.Emodin可增强顺铂对子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞生长抑制作用和诱导凋亡作用;降低子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞内ROS水平的作用;2.Emodin和顺铂联合使用可显著降低子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞中耐药基因P-gp、MRP1及BCRP的表达及其蛋白的表达,增加顺铂的化疗敏感性;3.Emodin和顺铂联合用药对Ishikawa细胞的生长抑制作用、促凋亡作用以及对耐药基因表达的抑制作用更加显著。第二部分 Emodin对子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用研究研究目的:构建人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型,探讨Emodin对荷瘤裸鼠的体内抗瘤效应。研究方法:Emodin与顺铂分别单独或者联合处理后的子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞,制成密度为1X 105的细胞悬液,通过皮下注射注入裸鼠的右前腿。建立子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型;分组分为对照组、Emodin单药组、顺铂单药组、Emodin和顺铂联合给药组四个组别。接种40天后,使用游标卡尺测量各组裸鼠皮下移植瘤的长短径并计算肿瘤体积。记录并计算小鼠的生存时间。研究结果:1.子宫内膜癌Ishikawa细胞和HEC-IB细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立:对照组Ishikawa细胞和HEC-IB细胞接种至裸鼠皮下,接种后接种部位可触及米粒大小结节,质韧,成瘤率100%。荷瘤裸鼠的一般状况良好,皮下移植瘤生长迅速。接种40天后,药物组各组裸鼠对药物耐受良好。2.Emodin和顺铂对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响:与未处理的对照组相比,单独使用Emmodin或顺铂处理,可使肿瘤体积减小,可是裸鼠的生存时间延长,两药联合给药组这些作用更加显著。结论:Emodin对人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长有抑制作用,并对顺铂抑制肿瘤生长有协同作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：
图１?Ｅｍｏｄｉｒｉ提髙了顺铂对子宫内膜癌细胞系生长的抑制作用??
图２?Ｅｍｏｄｉｎ通过增强子宫内膜癌细胞系的凋亡而提高化疗敏感性??
图３?Ｅｍｏｄｉｎ抑制子宫内膜癌细胞内的ＲＯＳ水平??
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本文编号：
2843941
