KNTC1调控宫颈癌发生发展及侵袭转移的初步研究

发布时间：2020-10-19 14:28

　　 研究背景子宫颈癌是威胁妇女生命健康常见的一种恶性肿瘤,在女性群体最常见诊断的肿瘤中它排第二位,我国宫颈癌发病数量约占全世界总数的1/3,它已经成为导致女性患癌死亡的重要原因,给我国女性的健康带来了严重的威胁。宫颈癌的发生与发展与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPVs)的感染密切相关,其中HPV16和HPV18是导致大多数hpv感染后诱发宫颈癌症的两种主要亚型。其编码的的早期蛋白E6、E7是导致宫颈细胞恶性转化的关键蛋白,它们可以分别抑制P53和降解pRb,使被感染的细胞无限增殖并恶变。然而,高危型HPV感染后仅有少数进展为恶性损害,HPVs的感染只是宫颈癌发生的充分而非必要条件,宫颈癌的侵袭和转移也不一定依赖于E6、E7的作用,宫颈癌发生发展的机制还有待进一步阐明。着丝点关联蛋白1(kinetochore associated 1,KNTC1)基因,又称ROD(rough deal)基因,定位于人12号染色体,其编码的蛋白是有丝分裂检查点的重要组成成分,该蛋白参与多种机制确保细胞有丝分裂过程中正确的染色体分离。KNTC1在宫颈癌中高表达,提示KNTC1可能参与了宫颈癌的发生发展,但是它在肿瘤中的作用的还不清楚,有待进一步研究。研究目的本课题拟利用细胞水平实验初步探究KNTC1在宫颈癌中的表达情况、对宫颈癌侵袭转移的影响及其可能的调控机制。研究方法1.收集正常宫颈与宫颈癌的新鲜组织标本、培养不同宫颈癌细胞株,提取RNA并逆转录为cDNA后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定KNTC1的相对表达量,对比正常宫颈与宫颈癌组织、不同细胞系之间KNTC1基因的表达差异;2.利用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)瞬时转染宫颈癌细胞系HeLa和SiHa,敲低KNTC1的表达后,通过Transwell迁移与侵袭实验检测KNTC1对细胞迁移及侵袭能力的影响;通过EdU试剂盒、平板克隆形成实验检测KNTC1对细胞增殖的影响;3.瞬时转染siRNA敲低目的基因后,Western Blot方法检测肿瘤上皮间质转化(EMT)相关分子生物学标记物在蛋白水平的变化;4.沉默HeLa细胞KNTC1的表达,送检mRNA表达谱芯片检测差异基因表达,结合KEGG pathway富集分析筛选出可能直接或间接受到KNTC1基因调控的下游的靶基因,寻找可能的调控机制。实验结果1.qPCR结果显示,相较于正常宫颈组织,宫颈癌组织KNTC1表达量较高且KNTC1在3种宫颈癌细胞系中均有表达;2.干扰KNTC1表达后,Transwell结果显示KNTC1敲低组的迁移和侵袭能力均明显增加;EdU、平板克隆形成实验结果显示KNTC1干扰组的增殖能力明显增强、克隆形成能力显著增加;3.siRNA抑制KNTC1表达后,宫颈癌细胞中上皮性标志物ZO1表达显著下降,间质性标志物Vimentin显著升高;4.mRNA芯片结果显示,HeLa细胞中沉默组与对照组差异表达基因与mTOR、TGF-β及同源重组等通路富集程度较高,还需进一步筛选研究。结论KNTC1在宫颈癌组织和细胞系中高表达,其异常的高表达对宫颈癌的发生发展起到抑制作用。KNTC1功能受损会促进宫颈癌细胞的增殖能力,并可能通过EMT途径增强宫颈癌细胞的迁移和浸润能力。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

为了验证ＫＮＴＣ１在宫颈癌组织中的表达水平，首先我们对从齐鲁医院收集的１２??例正常宫颈组织和２９例宫颈癌组织提取了总ＲＮＡ，并通过ｑＰＣＲ检测了?ＫＮＴＣ１??基因在两组ｍＲＮＡ水平上的相对表达量的差异（图１）。通过对两组数据进行双??向ｔ检验分析，我们得出结论：ＫＮＴＣ１在子宫颈肿瘤组织中的表达显著高于正??常宫颈组织，差异有统计学意义（Ｐ＝〇．〇２３１）。??１．２为了进一步探究ＫＮＴＣ１是否参与了宫颈癌的发生发展，我们从齐鲁医??院病例科采集到了与上述２９例宫颈癌组织中对应的２２例患者的临床病理信息。??根据组织中ＫＮＴＣ〗的表达水平，选取ｍＲＮＡ相对表达量的中位数（２＿ａａｑ??＝０．８２３４６５８７２９２８２），将其划分为ＫＮＴＣ１?高、低表达两组，随后利用卡方检??验分析ＫＮＴＣ１在宫颈癌表达程度地差异与分化程度、肿瘤大小、组织类型、ＦＩＧＯ??分期、浸润及转移等临床病理学参数的关系（表１）。我们发现ＫＮＴＣ］在宫颈癌??中表达的高低与肿瘤大小００．００８）以及淋巴结的转移（尸＝０．０３０）密切相关，??而与其他临床病理参数无明显相关性（Ｐ＞〇．〇５）。这一结果提示ＫＮＴＣ１可能与??宫颈癌的进展有关。??２７??

用ｑＰＣＲ在ｍＲＮＡ水平验证并对比３种ｓｉＲＮＡ的干扰效率。量化分??析显示３种ｓｉＲＮＡ序列均可千扰ＳｉＨａ细胞ＫＮＴＣ１的表达，ＫＮＴＣｌｉ－２３５６和??ＫＮＴＣｌｉ－５４３１两组干扰效率均可达到８０％以上（图２－Ｂ）。后续我们则选用??ＫＮＴＣｌｉ－２３５６进行细胞功能及蛋白水平的研究。??Ａ?Ｂ??＿?ＳｉＨａ??Ｉ?０．１５－，?｜?°－２５＇??．２?０．２０－?丁??０１０＇?ｇ－?０．１５－?Ｉ??Ｋ?ｍ??！?丨隱■?＾?０?０５＂?＊＊?＊＊?＂Ｔ＂??髮?〇〇〇丨?ｔ?丨?ｉ?丨丨－ｔ－Ｊ—ｚ?ｏ．ｏｏ－ＬＩ￣ｉ￣￣ｌ－７?１一ｌ—ｉ—??￥?／?Ｚ?ｃ／?，?＾?＾?＾?＾??＾?ｚ?ｚ?ｚ?ｚ??Ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?＾?＾?＾??图２?ＫＮＴＣ

图４敲低ＫＮＴＣｌ可促进宫颈癌细胞平板克隆形成??Ａ．ＨｅＬａ和ＳｉＨａ平板克隆染色结果Ｂ．ＨｅＬａ和ＳｉＨａ细胞ＮＣ组与ｓｉ组克隆形成数结果统计??５．下调ＫＮＴＣ１后，宫颈癌细胞的迁移和浸润能力增强??为了进一步验证ＫＮＴＣ１是否参与宫颈癌的侵袭转移，我们采用??ｓｉＲＮＡ－ＫＮＴＣｌ瞬时转染使ＨｅＬａ和ＳｉＨａ细胞中ＫＮＴＣ１表达沉默。利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ??小室检测对照组与干扰组细胞迁移和浸润能力的差异。结果表明，干扰组中ＨｅＬａ??和ＳｉＨａ穿过普通小室及铺有基质胶小室的细胞明显多于对照组（图５），证明抑??制ＫＮＴＣ１可促进ＨｅＬａ和ＳｉＨａ的迁移和浸润。??Ａ?ＮＣ?ｓｉＫＮＴＣＩ?Ｂ?ＮＣ?ｓｉＫＮＴＣＩ??
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本文编号：2847332