利用生物信息学分析高橄榄油饮食促进宫颈癌移植瘤生长的核心基因及通路

发布时间：2020-10-20 00:06

　　 目的:借助生物信息学及相关分析工具,对不同膳食油脂条件(高橄榄油饮食和对照饮食)喂养下的裸鼠宫颈癌转移瘤组织进行转录组测序(RNA-seq)分析,筛出与宫颈癌移植瘤增殖相关的差异表达基因,对这些上调或下调的差异基因进行相关功能注释分析及通路分析,通过以上这些生信分析结果,对差异表达基因可能的生物功能加以预测。通过相应生物信息学软件及算法在这些差异表达基因中筛选出核心基因,或是感兴趣的目的基因,以期找到能够解释高橄榄油饮食促进宫颈癌移植瘤生长的关键基因,并对其进行进一步深入研究。方法:第一部分:选取4周龄BALB/c背景的裸鼠,随机分为对照饮食组(Control Diet,CD)和高橄榄油饮食组(High Olive Oil Diet,OD),并用Hela细胞在裸鼠皮下注射造模。造模6周后收集肿瘤样本,并进行拍照及测量。并对肿瘤病理切片进行HE和PCNA染色。在体外利用橄榄油中主要成分油酸处理Hela细胞,利用长时间动态细胞成像及数据分析系统对油酸处理条件下细胞增殖状态进行动态检测,并利用EdU实验检测油酸处理条件下细胞群中进行处于DNA合成状态的细胞比例。第二部分:利用高通量转录组测序技术筛选对照组和高橄榄油饮食组移植瘤样本中DEGs(Differentially Expressed Genes),然后用DAVID数据库对上调和下调的基因分别进行GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,探索这些差异基因可能的相关的生物学功能及关键通路信息。为了进一步挖掘DEGs之间的相互联系,应用STRING数据库对差异基因进行蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction,PPI)的构建,并将分析结果数据通过Cytoscape软件将其可视化并利用其CytoNCA插件对PPI网络中每个节点(代表一个基因)的网络拓扑分析(节点度)进行计算,得到处于PPI网络中最核心地位的一组枢纽基因(Hub gene),同时用MCODE插件寻找PPI网络中的重要模块,根据设置参数得到三个重要模块及其包含的核心蛋白。最后,为验证转录组测序筛选的DEGs准确性,从生信分析得到一组核心基因组中,随机选取了5个DEGs,采用RT-qPCR方法验证了它们两组样本组织中mRNA表达水平差异。结果:第一部分:裸鼠皮下成瘤实验发现高橄榄油饮食组皮下肿瘤体积及重量均超过对照饮食组6倍(P0.05),同时肿瘤组织HE染色后可见OD组切片呈现更高的异质性,免疫组化分析揭示OD组中PCNA阳性细胞的显著增加。长时间动态细胞成像及数据分析系统对Hela细胞增殖状态监测显示48h时,油酸处理组细胞融合度为(72.8±1.6)%,较对照组(64.7±5.5)%显著增高(P0.05),EdU阳性细胞阳性率在油酸处理组为(36.6±1.1)%,较对照组(31.9±1.1)%明显增加(P0.05)。第二部分:不同膳食脂质喂养条件下两组肿瘤样本的转录组测序总共得到648个DEGs,其中包括155个上调的DEGs和493个下调的DEGs。GO功能分析和KEGG通路途径富集分析这些DEGs主要富集在转录调控(如EGR1和FOXN2)和细胞增殖(如TGFB2和COL4A3)。用STRING在线蛋白质互作数据库将符合标准的DEGs构建成PPI网络后,利用Cytoscape的MCODE插件得出三个重要的亚网络,并且根据节点度的大小(节点度8),由高到低得到15个核心蛋白,并将这15个核心蛋白映射到模块上,可见相当一部分核心蛋白处于上述的模块中。通过实时定量PCR分析确认包括JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1的中枢基因。RT-qPCR检测的5个DEGs(JUN,TIMP3,OAS1,OASL和EGR1)的变化趋势和转录组测序结果一致。结论:高橄榄油饮食喂养在体内有助于宫颈癌Hela细胞生长,并且油酸在体外可提升其的增殖潜能,随后全面的生物信息学分析显示,不同膳食喂养条件下的小鼠移植瘤组织之间存在明显的基因表达模式差异,这种表达模式差异具体体现在一组重要的核心基因的表达差异及相关信号通路变化,这些核心基因为我们进一步研究宫颈癌潜在的机制提供了的方向,而且它们有望成为宫颈癌诊断和治疗潜在的靶点,当然这些核心基因的具体机制我们仍然需要通过进一步的实验研究来证明。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

18橄榄油饮食喂养加剧 Hela 宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长。（A）两组模型小鼠肿瘤拍照图片（B）6 周皮下瘤测量数据绘制生长曲线（C）肿瘤组织重量比较，*Pigure 1 High olive oil diet feeding promotes the growth of xenografts in nude mice. presentative graph of tumours formed by the implantation of HeLa cells under diffes (B) Analysis of tumour growth curves over a 6-week time course (C) Tumour weigdifferent diet groups of nude mice, *P < 0.05.高橄榄油饮食喂养组肿瘤具有更高的异型性和增殖状态为了评估不同膳食营养下的肿瘤组织异质性以及肿瘤细胞增殖状态，将组织切片进行了 H＆E 染色和免疫组化 PCNA 染色。如图 2 所示，可见相比，OD 组肿瘤切片呈现出核色素过度增已经和细胞核与细胞质比率 OD 组肿瘤更差的分化和更高的异质性（图 2 A）。同样，IHC 结果表 PCNA 阳性细胞数比例显着增加，提示细胞增殖更活跃（P<0.001，图

图 2 高橄榄油饮食下肿瘤呈现更高的异型性和增殖状态。（A）肿瘤切片 HE 染色。（B）免疫组化肿瘤组织 PCNA 染色（C）PCNA 染色阳性细胞比例靶图，***P < 0.001。Figure 2 High olive oil diet feeding group xenograft tissues exhibited poor differentiation,higher heterogeneity and more active proliferation. (A) H&E-stained sections of xenografts (B)Immunohistochemical staining of tumour sectios using an anti-PCNA antibody (C)quantification of the percentage of the PCNA-positive area, ***P < 0.001.2.3 体外实验油酸促进宫颈癌 Hela 细胞增殖鉴于油酸（Oleic acid, OA）是橄榄油中含量最丰富（超过 70％）、最重要的功能性营养成分，我们在体外实验中采用 OA 来探索橄榄油对癌细胞功能的调节作用，实验分为对照组（Negative Control, NC）和 OA 处理组（OA 浓度为 10μM）。对细胞增殖状态的检测应用了长时间动态细胞成像系统（Incucyte ZOOM）和 EdU实验，如图 3 所示：使用 IncuCyte ZOOM 对两组细胞增殖状态进行近 2 天的动态观察，将拍照统计得到的融合度数据进行曲线作图。可见 48h 时，OA 组细胞融合

20图 3 体外实验油酸促进宫颈癌 Hela 细胞增殖。（A）Incucyte ZOOM 检测 OA 处理后细胞增殖曲线及 48h 时两组细胞融合情况拍照。（B）EdU 实验检测 DNA 合成情况；EdU 染色（红色）、细胞核用 Hoechst33342 染色（蓝色）；并对 48h 时 EdU 阳性细胞比例进行靶图定量，*P < 0.05，***P < 0.001。Figure 3 OA accelerates HeLa cell proliferation in vitro. (A) Growth curves for HeLa cellstreated with or without OA were analysed using an IncuCyte incubator microscope and themean confluence values were compared at 48 hrs (B) DNA synthesis of HeLa cells subjected tothe EdU incorporation assay. EdU staining (red). Cell nuclei were stained with Hoechst33342(blue). The quantification of EdU-positive cells was conducted macroscopically and wasexpressed as a percentage relative to the control cells, *P < 0.05, ***P < 0.001.
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本文编号：2847903