研究背景宫颈癌(cervical cancer)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,虽然随着医疗技术发展,该疾病发病率持续降低,但其发病率在女性恶性肿瘤中仍位居第二位,全球每年约有46万新发病例,仅次于乳腺癌;而死亡率为第四位,每年约有27万死亡病例,绝大部分来自于发展中国家。研究表明,超过99%的宫颈癌是因人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)引起的。HPV主要通过性接触或者皮肤接触传播,随着性观念开放和环境污染,子宫癌发病率正呈现出年轻化趋势。目前已发现100多种不同类型的HPV,有14种类型属于导致宫颈癌的“高风险”型HPV,其中70%的宫颈癌病例是由HPV-16型和HPV-18型引起的。虽然,预防性HPV疫苗最近已经问世,而且HPV疫苗临床使用安全性好,世界卫生组织也鼓励合适人群通过接种HPV疫苗来降低宫颈癌的发病率。然而,与宫颈癌发生的高危HPV亚型有14种,但目前已有疫苗只能针对其中的几种,比如最常用的HPV 2价疫苗是针对高危的HPV-16 型和 HPV-18 型,HPV 9 价疫苗可防治 16、18、31、33、45、52 和 58型七种高危型HPV病毒和6、11两种低危型HPV病毒。此外,宫颈癌疫苗面世时间尚短,实际保护效果还是通过长时间观察才能确认。基于上述原因,宫颈癌发生和发展的机制研究仍需要继续,并为新型诊断标志物和治疗靶点筛选提供理论基础。HPV感染导致宫颈癌的发病机制仍不明确,因此宫颈癌的筛查和诊断还需依赖液基细胞学、HPV DNA检测,阴道镜检查,宫颈碘试验以及宫颈组织病理检查等方法。但由于检查费用以及操作技术要求,导致上述检测方法无法在发展中国家普及,目前也缺乏特异性强且易于操作的标志物用于宫颈癌临床筛查。此外,手术和放化疗联合仍是宫颈癌治疗的首选,然而宫颈癌病人预后差,治疗后5年生存率不足40%,甚至晚期病人复发率超过30%。因此,科研人员致力于寻找可在分子水平早期诊断和治疗宫颈癌的新手段。越来越多研究发现HPV通过调控宿主细胞的微小RNA(microRNA,miRNA)促进宫颈癌的发生和发展。miRNA是一类有内源基因编码的长度约20-25nt的非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3'非编码区域(3' ultranlated region,3'UTR)互补结合来抑制靶基因的翻译,在转录后水平调控多种细胞功能。miRNA在癌症的发生、发展和转移中发挥着十分重要的功能,既可以作为癌基因,降低抑癌基因表达;也可作为抑癌基因,抑制原癌基因活性或上调抑癌基因的活性。在宫颈癌发生和发展的每个阶段,包括癌前病变到后期转移,都有相应的miRNA参与其中。例如,HPV感染宿主细胞后通过抑制miR-3156-3p表达来促进宫颈癌细胞生长和迁移。相反,高危的HPV-E7病毒通过TGF-β/Smad4分子通路增强miR-182表达,从而促进宫颈癌的发生。此外,miR-944高表达可作为宫颈癌预后差的标志。因此,miRNA有望成为宫颈癌新型诊断标志物和潜在治疗靶点。多项研究表明,miR-494是一个抑癌基因。在口腔癌中,miR-494通过降低同源盒蛋白A 10(Homeobox protein A10,HOXA10)表达来抑制口腔癌细胞的生长。而在乳腺癌中,miR-494通过减少趋化因子受体CXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor 4)表达来降低Wnt/β-catenin分子通路活性,最终抑制乳腺癌的发生。此外,华蟾素(cinobufacin)通过调控miR-494来抑制胃癌细胞增殖。还有研究发现miR-494通过调低c-Myc和成纤维细胞生长因子受体2(Fibroblast Growth Factor Receptor 2,FGFR2)表达来抑制卵巢癌细胞生长。然而,miR-494在宫颈癌中的作用却鲜有研究,仅有个别研究认为miR-494通过减少垂体瘤转化基因1(pituitary tumor-transforming 1,PTTG1)表达来抑制宫颈癌细胞转移。不过该文章已被退稿,实验结果有待验证。作为miR-494潜在靶基因的细胞因子信号转导抑制因子6(suppressor of cytokine signaling,SOCS6)同样也是一个抑癌基因。SOCS 的全称是 Suppressor of cytokine signaling细胞因子信号抑制物,细胞因子与相应的受体结合可导致信号传导通路的活化,而将细胞因子的信号由胞膜传到胞浆并最终传至胞核,并引起目的基因的表达。目前研究发现,SOCS至少有8种成员,SOCS1-7和CIS。表达的异常可以导致小鼠免疫功能异常。前期研究表明SOCS6是miR-494的靶基因。先前有研究表明SOCS6有抑制肿瘤生长、侵袭和迁移等作用,在大肠癌中,miR-301a通过降低SOCS6表达来促进大肠癌细胞生长和侵袭。miR-424-5p通过抑制SOCS6表达促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。miR-21和miR-155通过抑制SOCS6表达来促进肺癌发生和发展。而且SOCS6表达缺失预示着肺癌预后的低生存率。此外还有文章报道SOCS系统也可发挥促进癌症发展的作用,SOCS1蛋白的过表达与三阴性乳腺癌临分期,淋巴结转移,远处转移和组织学恶性程度明显相关。与miR-494情况类似,SOSC6在宫颈癌中的作用还未有报道。目的(1)明确miR-494在健康人和宫颈癌病人血清以及miR494和SOSC6在癌组织和癌旁组织中的表达;(2)确认宫颈癌病人血清中miR-494的表达水平与其临床病理学特征和5年存活率之间的关系;(3)探索miR-494和SOSC6靶向调控关系;(4)在体外细胞水平上明确miR-494和SOSC6对宫颈癌细胞生长和迁移的影响;(5)在体内动物水平上确认miR-494和SOSC6对宫颈癌形成的影响。方法(1)利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法,检测健康人和宫颈癌病人血清中、宫颈癌病人术前与术后一周血清中以及宫颈癌病人肿瘤组织与癌旁组织中miR-494的表达水平;(2)通过相关性分析评估宫颈癌病人血清中miR-494的表达水平与其临床病理学特征和预后之间的关系;(3)利用qRT-PCR和蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)方法,检测宫颈癌病人肿瘤组织与癌旁组织中SOSC6的表达水平;(4)利用qRT-PCR和WB方法,检测多种宫颈癌细胞系中miR-494和SOSC6的表达水平;(5)合成 miR-494 mimics 和 inhibitors 以及 SOSC6 的干扰小 RNA(siRNA),转染宫颈癌细胞系Hela后利用qRT-PCR检测miR-494和SOSC6的表达水平;(6)利用shRNA载体构建SOSC6表达载体,通过测序进行鉴定后转染宫颈癌细胞系Hela,然后采用qRT-PCR检测SOSC6的表达水平;(7)利用psiCHECKTM-2载体构建含SOSC6野生型3'UTR和突变型3'UTR的荧光素酶报告基因载体,并通过测序进行鉴定;(8)利用荧光素酶报告基因系统明确miR-494对SOSC6的靶向调控作用;(9)利用MTS和平板克隆形成实验,检测miR-494和SOSC6对宫颈癌细胞生长的影响;(10)利用流式细胞技术,检测miR-494和SOSC6对宫颈癌细胞凋亡和周期的影响;(11)利用Transwell小室技术,检测miR-494和SOSC6对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响;(12)利用裸鼠成瘤实验,检测miR-494和SOSC6对宫颈癌形成的影响。结果(1)相比于健康人,宫颈癌病人血清中的miR-494表达水平显著降低;90%宫颈癌病人术后一周血清中的miR-494表达水平与术前相比有所升高;此外,宫颈癌病人肿瘤组织的miR-494表达明显低于癌旁组织中的表达;(2)血清中的miR-494与肿瘤大小、肿瘤分化和预后关系密切;(3)相比于宫颈癌病人的癌旁组织,宫颈癌病人肿瘤组织中的SOSC6表达水平显著降低;(4)相比于人正常宫颈内膜上皮细胞End1/E6E7,人宫颈癌细胞系中的miR-494表达水平明显降低,同时SOSC6的表达水平(包括mRNA和蛋白)也显著降低;(5)miR-494 mimics 和 inhibitors 以及 SOSC6 的干扰小 RNA(Small interfering RNA,siRNA)在宫颈癌细胞系Hela细胞中成功调控miR-494和SOSC6的表达;(6)把 SOSC6 的开放阅读框(open reading frame,ORF)克隆到 shRNA 载体并通过测序鉴定后成功构建SOSC6表达载体,而且可以在宫颈癌细胞系Hela细胞中表达SOSC6;(7)把SOSC6野生型3'UTR和突变型3'UTR克隆到psiCHEClKTM-2载体并通过测序鉴定后成功构建 psiCHECKTM-2-SOSC6野生型 3'UTR和psiCHECKTM-2-SOSC6突变型3'UTR荧光素酶报告基因载体;(8)荧光素酶活性检测结果显示miR-494对SOSC6有靶向调控作用;(9)MTS和平板克隆形成实验结果显示,miR-494和SOSC6均抑制宫颈癌细胞生长;(10)流式细胞实验结果显示,miR-494过表达抑制宫颈癌细胞从G1期进入S期,以及显著诱导宫颈癌细胞凋亡;miR-494沉默加快宫颈癌细胞从G1期进入S期,以及抑制宫颈癌细胞凋亡;SOSC6过表达抑制宫颈癌细胞从G1期进入S期,以及显著诱导宫颈癌细胞凋亡;SOSC6沉默加快宫颈癌细胞从G1期进入S期,以及抑制宫颈癌细胞凋亡;(11)Transwell小室实验结果显示,miR-494过表达抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭,而miR-494沉默则促进宫颈癌细胞迁移和侵袭;SOSC6过表达抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭;(12)裸鼠成瘤实验结果显示,miR-494过表达抑制宫颈癌肿瘤形成,而miR-494沉默则抑制宫颈癌肿瘤形成;SOSC6过表达抑制宫颈癌肿瘤形成,相反,SOSC6沉默则促进宫颈癌肿瘤形成。结论(1)miR-494在宫颈癌病人血清以及癌组织中低表达,且在90%手术后的宫颈癌病人血清中高表达,SOSC6在宫颈癌组织中低表达;(2)miR-494与宫颈癌肿瘤大小,肿瘤分化和预后密切相关;(3)首次在宫颈癌中确定了 miR-494和SOSC6的互作以及miR-494对SOSC6的靶向调控作用;(4)细胞实验和动物实验都证实miR-494对SOSC6的靶向调控作用,已经明确miR-494和SOSC6通过对宫颈癌细胞生长、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭的调控来影响宫颈癌发生和发展;(5)miR-494和SOSC6对宫颈癌发生发展的机制阐述可为宫颈癌早期诊断提供分子指标,以及为后续的治疗提供新的靶点。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：
发展和转移［２８－３２］。ｍｉＲＮＡ是一类有内源基因编码的长度约２０－２５ｎｔ的非编码??ＲＮＡ，本身不翻译蛋白，通过与靶基因ｍＲＮＡ的３＇非编码区域互补结合来抑制??靶基因的翻译，在转录后水平调控多种细胞功能（图１）?［３３，３４］。ｍｉＲＮＡ在多种??癌症的发生、发展和转移中发挥着十分重要的功能，既可以作为癌基因，降低抑??癌基因表达，也可作为抑癌基因，抑制原癌基因活性［３４－３６］。??１６??
通过对健康人和宫颈癌病人的外周血清中的ｍｉＲ－４９４表达情况进行检测，我??们发现，相比于健康人，宫颈癌病人血清中的ｍｉＲ－４９４表达水平显著降低（尸＜０．０５）??（图２），这预示着ｍｉＲ－４９４可能对于宫颈癌发生和发展有重要的作用。??ｍｉＲ－４９４?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??６－??ｃ?？▲癱畚??｜?？？？？？？？？??Ｓ?４－??Ｉ?，??〇??＾?２－?■■麵■??１?被??０Ｊ?１?１???／?／??图２健康人和宫颈癌病人血清中ｍｉＲ－４９４表达的比较情况??１．２?ｍｉＲ－４９４在宫颈癌病人术前与术后一周血清中的表达情况??接着，我们对１４例宫颈癌患者（术前与术后一周均有冻存血浆的患者）的??外周血检测ｍｉＲ－４９４的表达水平，发现９０％的宫颈癌病人术后一周血清中的??ｍｉＲ－４９４表达水平与术前相比有所升高，提示ｍｉＲ－４９４可能对宫颈癌预后有指示??作用（Ｐ＜〇＿〇５）（图?３）。??４２??
１．３?ｍｉＲ－４９４在宫颈癌病人肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况??为明确ｍｉＲ－４９４在宫颈癌组织中的表达情况，我们也在宫颈癌病人的肿瘤组??织和癌旁组织中检测ｍｉＲ－４９４的表达水平，结果显示宫颈癌病人肿瘤组织的??ｍｉＲ－４９４表达明显低于其在癌旁组织中的表达（ＰＣ０．０５）（图４）。??４３??
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本文编号：
2852274
