目的:妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)作为产科常见的危及母胎生命的一组疾病,占全部妊娠的5%~10%,可在妊娠期间内发生,也可为原有高血压在妊娠期的进一步发展。主要分为:妊娠期高血压,子痫前期(轻度和重度),子痫,慢性高血压并发子痫前期,慢性高血压合并妊娠。其基本病理生理变化为全身小血管的痉挛、内皮的损伤及局部的出血。随着HDCP与离子通道研究的进展,越来越多的证据显示HDCP的发生发展与离子通道有一定联系,尤其是与钾通道之间的联系最为密切,ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)作为众多钾通道中的一种,由结构亚基内向整流钾通道(inwardly rectifying potassium channel,Kir)和调节亚基磺酰脲受体(sulphonylurea receptor,SUR)组成,广泛存在于多种可兴奋细胞中。已有研究表明Kir6.1、SUR2B在人类正常妊娠子宫平滑肌细胞中有表达,但KATP通道在病理妊娠如妊娠期高血压疾病中表达情况研究甚少,故本实验采用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR experiment,QPCR)和蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测KATP在正常与重度子痫前期孕妇、早发型重度子痫前期与晚发型重度子痫前期孕妇、重度子痫前期合并胎儿生长受限与未合并胎儿生长受限孕妇胎盘绒毛膜板动脉(Placental Chorionic plate arteries,CPAs)血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle cell,VSMC)中的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)及蛋白表达水平,分析正常组与重度子痫前期组、晚发型重度子痫前期组与早发型重度子痫前期组、重度子痫前期合并胎儿生长受限与未合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中KATP表达的差异及其在病理状态下的功能改变,探讨CPAs血管平滑肌中KATP通道与重度子痫前期的关系,为临床预防治疗提供新思路。方法:(1)选择本院产科收治的经阴道分娩或剖宫产正常孕妇CPAs血管为实验组,正常孕妇子宫平滑肌为阳性对照组,蒸馏水为空白对照组,样品充分研磨并提炼出总RNA,反转录为互补DNA(complementary DNA,cDNA),半定量PCR法扩增cDNA,电泳扩增产物并成像保存,肉眼直观对比CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1及SUR2B亚基的表达与否。(2)收集本院产科收治的正常孕妇产后胎盘绒毛膜板动脉血管15例,同期重度子痫前期孕妇产后胎盘绒毛膜板动脉血管15例,(1)提炼总RNA并反转录为cDNA,将甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)设为参照基因,进行QPCR,得到对应Ct值并计算出ΔCt值(目的基因Ct值与内参照基因Ct值之差),ΔΔCt值(实验组基因ΔCt值与对照组基因ΔCt值之差)及2~(-ΔΔCt)值(即表示实验组基因与对照组基因的比值数),分析两组CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1及SUR2B亚基mRNA表达量及差异;(2)提取两组胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌总蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,转到PVDF膜上,脱脂牛奶封闭后孵育一抗及二抗,化学发光成像系统成像并保存,所得图像用Fion进行灰度分析,分别与GAPDH内参蛋白进行比较,得到目的蛋白的相对表达量及灰度值。QPCR及Western blotting实验结果均以均数±标准差(xˉ±s)表示,以SPSS 19.0进行t检验,P0.05认为差异有统计学意义。(3)收集本院产科终止妊娠的晚发型重度子痫前期患者胎盘绒毛膜板动脉血管15例,同期终止妊娠的早发型重度子痫前期患者胎盘绒毛膜板动脉血管15例,以及重度子痫前期合并胎儿生长受限及未合并胎儿生长受限的胎盘绒毛膜板动脉血管各15例,采用同样的方法进行QPCR及Western blotting实验,对比分析晚发型及早发型重度子痫前期、重度子痫前期合并胎儿生长受限与未合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中KATP通道Kir6.1亚基与SUR2B亚基mRNA及蛋白表达差异。结果:(1)对于Kir6.1和SUR2B亚基,子宫平滑肌阳性对照组能够电泳出相应条带,胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌组也能电泳出同样大小的条带,蒸馏水组不能电泳出条带;(2)对比分析正常胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌组及重度子痫前期胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌组,(1)QPCR结果:15例正常CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为5.2808±0.34160,15例重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为5.0212±0.45322,两组比较差异无统计学意义(P=0.0890.05);15例正常CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为3.9898±0.3376,15例重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为7.5576±1.4001,两组比较差异有统计学意义(P0.001),计算出其2~(-ΔΔCt)值为0.2091±0.3063,提示重度子痫前期组CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基mRNA水平低于正常组;(2)Western blotting结果:15例正常CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.7383±0.1781,15例重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.7728±0.1060,两组比较差异无统计学意义(P=0.7190.05);15例正常CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.7317±0.0497,15例重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.4367±0.06327,两组比较差异有统计学意义(P0.001)。(3)对比分析晚发型重度子痫前期及早发型重度子痫前期胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌组,(1)QPCR结果:15例晚发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为5.2517±0.4181,15例早发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为5.0917±0.5105,两组比较差异无统计学意义(P=0.3560.05);15例晚发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为6.3931±0.4527,15例早发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为9.9218±0.3897,两组比较差异有统计学意义(P0.001),计算出其2~(-ΔΔCt)值为0.0959±0.0439,提示早发型重度子痫前期组CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基mRNA水平低于晚发型重度子痫前期组;(2)Western blotting结果:15例晚发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.7143±0.07639,15例早发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.6859±0.0924,两组比较差异无统计学意义(P=0.4330.05);15例晚发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.4273±0.05377,15例早发型重度子痫前期CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.2012±0.03784,两组比较差异有统计学意义(P0.001)。(4)对比分析重度子痫前期合并胎儿生长受限及未合并胎儿生长受限胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌组,(1)QPCR结果:15例重度子痫前期合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为4.7257±0.4392,15例未合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1亚基ΔCt值为4.6794±0.3674,两组比较差异无统计学意义(P=0.7570.05);15例重度子痫前期合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为9.8608±0.4154,15例未合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基ΔCt值为6.6552±0.4393,两组比较差异有统计学意义(P0.001),计算出其2~(-ΔΔCt)值为0.1125±0.0422,提示重度子痫前期合并胎儿生长受限组CPAs血管平滑肌中SUR2B亚基mRNA水平低于未合并胎儿生长受限组;(2)Western blotting结果:15例重度子痫前期合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.7889±0.04964,15例未合并胎儿生长受限组CPAs血管平滑肌中Kir6.1/GAPHD灰度值比值为0.7847±0.02936,两组比较差异无统计学意义(P=0.8750.05);15例重度子痫前期合并胎儿生长受限CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.2106±0.0849,15例未合并胎儿生长受限组CPAs血管平滑肌中SUR2B/GAPHD灰度值比值为0.4004±0.04185,两组比较差异有统计学意义(P0.001)。结论:(1)由成像条带图可知,CPAs血管平滑肌中存在KATP通道Kir6.1及SUR2B亚基的表达。(2)正常孕妇及重度子痫前期孕妇胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌中KATP通道Kir6.1亚基的mRNA及蛋白表达无明显区别,SUR2B亚基在重度子痫前期孕妇中的mRNA及蛋白表达均较正常孕妇降低,提示KATP通道SUR2B亚基的表达水平改变可能与重度子痫前期的发生发展有关。(3)与晚发型重度子痫前期相比,KATP通道Kir6.1亚基的mRNA及蛋白表达在早发型重度子痫前期胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌中无明显差异,而SUR2B亚基的mRNA及蛋白表达均更低,提示重度子痫前期发生的时间早晚可能与KATP通道SUR2B亚基下降的程度有关。(4)与重度子痫前期未合并胎儿生长受限相比,KATP通道Kir6.1亚基的mRNA及蛋白表达在重度子痫前期合并胎儿生长受限胎盘绒毛膜板动脉血管平滑肌中无明显差异,而SUR2B亚基的mRNA及蛋白表达均更低,提示胎儿生长受限可能与KATP通道SUR2B亚基下降的程度有关。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714.244
【文章目录】：中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
英汉缩略词对照表
致谢
ATP敏感性钾通道与血管平滑肌关系及其研究进展（综述）
参考文献
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