Linc00312通过miR-196a-5p调节ZMYND11逆转卵巢癌化疗耐药性的作用与机制研究

发布时间：2020-10-27 09:36

　　 目的:卵巢癌是导致女性癌症患者死亡的主要原因。已有许多药物用于治疗卵巢癌并可以改善患者的预后。以铂类为基础的化疗已成为局部晚期或转移癌患者的一线治疗方案,但临床化疗耐药性是晚期卵巢癌患者治疗的主要障碍,因此,如何逆转卵巢癌的化疗耐药性成为国内外研究的热点问题。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的、不编码蛋白的RNA,已被证实为人类各种癌症发生与发展的调节因子。目前,许多测序技术已经表明LncRNAs在耐药和敏感的癌症细胞中存在差异表达,并通过细胞信号传导通路、DNA损伤修复作用、DNA甲基化等途径影响癌细胞对化疗药物的耐药性。因此,研究LncRNAs在肿瘤发生、发展以及放疗、化疗敏感性中的作用和潜在的分子机制具有重大的临床意义。同时,研究发现LncRNAs可作为内源性竞争性RNA,通过miRNA反应元件与microRNAs及其下游靶基因直接结合,互相调控彼此的表达水平和生物学功能。Linc00312,位于染色体3p25.3上,在多种疾病中的表达显着失调,并作为肿瘤抑制基因起着关键作用。此外,Linc00312通过与特定miRNA相互作用在细胞增殖、细胞凋亡、分化和转移中发挥重要作用。但Linc00312与卵巢癌化疗耐药性的关系及分子机制尚不清楚。本研究以Linc00312为研究对象,采用qRT-PCR与原位杂交技术深入了解其与卵巢癌化疗耐药性的相关关系;构建siRNA以及过表达质粒,通过CCK-8、流式细胞术、Western Blot等实验方法探索Linc00312逆转卵巢癌对顺铂化疗耐药性的作用机制;通过软件预测寻找其直接结合的microRNA及其靶基因,同时明确miR-196a-5p与ZMYND11在逆转卵巢癌对顺铂化疗耐药性中的作用以及三者之间的相关性,进而阐明Linc00312可通过抑制miR-196a-5p调控靶基因ZMYND11的表达,从而逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性,为探索卵巢癌的治疗方法提供了新的思路。研究方法:第一部分:利用qRT-PCR与原位杂交检测Linc00312在卵巢浆液性癌组织中的表达,并通过对患者预后随访,统计Linc00312与卵巢癌临床病理生物学特征的相关性。qRT-PCR检测卵巢癌敏感细胞系SKOV3与耐药细胞系SKOV3/DDP中Linc00312的差异表达。分别转染Linc00312 siRNA和过表达质粒至SKOV3与SKOV3/DDP内,CCK-8检测经顺铂处理后细胞抑制率,并计算半抑制浓度IC50;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR与Western Blot检测耐药相关蛋白MDR1、MRP1以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA与蛋白水平的变化情况。第二部分:通过软件预测分析寻找Linc00312相互作用的microRNA。利用qRT-PCR检测miR-196a-5p在卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织和细胞中的差异表达,并利用Pearson相关性分析判断Linc00312与miR-196a-5p的相关关系。转染 miR-196a-5p mimics 与 inhibitor,利用 CCK-8、Annexin V-FITC 细胞凋亡实验、Western Blot检测miR-196a-5p与卵巢癌对顺铂化疗耐药的相关性。利用qRT-PCR检测Linc00312与miR-196a-5p之间的调控关系;进一步构建PMIR-Linc00312,通过荧光素酶报告基因实验检测Linc00312与miR-196a-5p的直接调控关系。第三部分:利用免疫组化与Western Blot检测ZMYND11在卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织中的表达情况,并统计分析其与卵巢癌临床病理生物学特征的相关关系。利用qRT-PCR与Western Blot检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞中ZMYND11的差异表达。转染ZMYND11 siRNA和过表达质粒,CCK-8、Annexin V-FITC细胞凋亡实验、Western Blot检测不同表达水平的ZMYND11对卵巢癌化疗耐药的影响。转染Linc00312 siRNA、过表达质粒以及miR-196a-5p mimics、inhibitor,利用Western Blot检测ZMYND11的蛋白水平变化,验证二者对ZMYND11 的调控作用。通过 TargetScan 预测 miR-196a-5p 与 ZMYND11 3'UTR 的结合位点,利用荧光素酶报告基因实验验证Linc00312可通过miR-196a-5p调控ZYMND11。结果:第一部分:Linc00312在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中的表达显著低于化疗敏感组织,且主要在细胞浆中表达;其低表达与卵巢癌的FIGO分期有关,但与患者年龄、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无明显相关性。Linc00312在卵巢癌化疗耐药细胞系SKOV3/DDP中的表达显著低于敏感细胞系SKOV3。抑制Linc00312的表达,顺铂处理后,SKOV3细胞抑制率降低、凋亡率减少,IC50由4.297±0.148ltg/ml增高至6.308±0.299μg/ml。耐药相关蛋白MDR1与MRP1、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2mRNA与蛋白表达水平增高,而Bax、Caspase-3、Caspase-9表达水平显著降低。Linc00312过表达后,SKOV3/DDP则出现相反趋势。第二部分:miR-196a-5p在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中的表达显著高于化疗敏感组织。与SK0V3相比,miR-196a-5p在SKOV3/DDP中表达增高。在SKOV3细胞中,与对照组相比,miR-196a-5pmimics组的细胞抑制率、凋亡率明显下降,顺铂对细胞的IC50升高;在SKOV3/DDP细胞中,与对照组相比,miR-196a-5p inhibitor组中的细胞抑制率、凋亡率显著增高,IC50降低。Linc00312与miR-196a-5p之间存在靶向结合位点,可负向调控彼此的表达水平,并共同抑制MDR1、MRPI蛋白表达,从而逆转卵巢癌对顺铂的耐药性。第三部分:与卵巢癌化疗敏感组织和细胞相比,ZMYND11在耐药组织和细胞中呈低表达,且其低表达与卵巢癌患者年龄、FIGO分期、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无相关性。ZMYND11的低表达可使SKOV3细胞抑制率、凋亡率下降,IC50升高,MDRI、MRP1的表达增高;而在SKOV3/DDP细胞中高表达后,上述趋势刚好相反。敲低Linc00312的表达,ZMYND11的蛋白表达水平显著降低;而过表达Linc00312后,ZMYND11的蛋白表达水平亦随之升高。MiR-196a-5p与ZMYND11亦存在靶向结合位点;Linc00312与miR-196a-5p可共同调控ZMYND11的mRNA与蛋白表达水平,从而影响卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。结论:第一部分:与卵巢癌化疗敏感组织与细胞相比,Linc00312在化疗耐药组织和细胞中呈低表达,且其低表达与卵巢癌的FIGO分期有关;Linc00312可通过Bcl-2/Caspase-3细胞凋亡途径逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性;第二部分:miR-196a-5p在卵巢癌化疗耐药组织和细胞中呈高表达;Linc00312可通过抑制miR-196a-5p的表达逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性;第三部分:ZMYND11在卵巢癌化疗耐药组织和细胞中呈低表达,其低表达与卵巢癌患者年龄、FIGO分期、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无相关性;Linc00312通过miR-196a-5p调控靶基因ZMYND11的表达逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 Linc00312 在卵巢癌化疗耐药与敏感组织中的表达首先，我们采用 qRT-PCR 方法检测卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织各 60 例中 Linc00312 的表达，发现，与化疗敏感组织相比，化疗耐药组织中 Linc00312 的表达水平显着降低（P<0.01）（图 3.1.1A，△ct 值越高，表达量越低）。进一步制作ROC 曲线分析通过 Linc00312 来评估卵巢癌患者化疗耐药与否的准确性，提示 AUC为 0.907， 95％CI：0.854-0.960（P<0.01）（图 3.1.1B）。当 cut-off 值为 7.522 时，其灵敏度为 91.7％，特异性为 80％。

图 3.1.2 ISH 检测在卵巢浆液性癌石蜡组织切片中 Linc00312 的表达。A，C：化疗敏感组织，A×200，C×400; B，D：化疗耐药组织，B×200，D×400表 3.1 ISH 检测在卵巢浆液性癌石蜡组织切片中 Linc00312 的表达N Linc00312 表达 高表达数 高表达率 P分组 - + ++ +++ N (%)敏感 40 0 16 19 5 24 60.0耐药 40 0 29 11 0 11 27.5 0.0389注：* 敏感 vs. 耐药, * P = 0.03893.2 Linc00312 与卵巢浆液性癌临床病理生物学特征的相关性通过对卵巢浆液性癌石蜡组织切片患者的随访，我们发现 Linc00312 的表达降低与卵巢癌的 FIGO 分期有关（P=0.042），但与患者年龄、肿瘤分化以及淋巴结转

I 19 16 3 IV 61 29 32化 13 8 5 化 67 37 30移 44 17 27 36 28 82 在卵巢癌细胞中的表达情况Real-time PCR 检测人卵巢癌细胞 SKOV3 与 达情况，结果发现，与 SKOV3 相比，SKOV3/DDPP <0.01，图 3.3）。
【相似文献】

相关博士学位论文 前2条

1 张传琪;Linc00312通过miR-196a-5p调节ZMYND11逆转卵巢癌化疗耐药性的作用与机制研究[D];中国医科大学;2019年

2 杨吉鹏;ZMYND11在多形性胶质母细胞瘤中作用及机制的研究[D];河北医科大学;2018年

本文编号：2858354