σ1受体及其干预对宫颈癌细胞TRAIL诱导剂的增敏作用

发布时间：2020-10-29 13:59

　　 背景和目的宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康,其发病呈年轻化趋势,且发病率呈逐年升高,对患者的身心健康产生严重威胁。宫颈癌的主要病因是高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染,HPV编码的病毒癌蛋白可影响细胞周期进展、凋亡和分化,使抑癌基因和促凋亡蛋白失活或降解,进而使细胞发生癌变。传统的手术及放、化疗在局部晚期宫颈癌及复发性宫颈癌患者中未能取得满意的疗效。靶向治疗在细胞分子水平上,对已明确的致癌位点设计相应的治疗药物,药物在体内特异性结合致癌位点,使肿瘤细胞特异性死亡,而对正常组织细胞无杀伤作用。最新的靶向治疗和免疫治疗研究方面取得了较为满意的进展,为患者带来新的选择和希望。因此,函待开发更多有效的靶向药物,必将为宫颈癌患者的治疗提供更多的益处。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导因子(The tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand,TRAIL)是一种能特异性识别肿瘤细胞死亡受体的因子,其可通过结合死亡受体结构域,启动下游凋亡程序,高效性、高选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡,对正常组织和细胞无明显毒性副作用,是较为有效的分子靶向治疗位点。TRAIL因其对肿瘤细胞的特异杀伤作用而有广泛的应用前景,但许多临床研究表明癌细胞产生TRAIL耐药性,最终逃避TRAIL诱导的凋亡。明确TRAIL激活凋亡的机制对于开发TRAIL在临床应用中最大限度发挥其潜在有效性的策略至关重要。σ受体(σR)是一种独特的非阿片受体蛋白,可分为σ1R和σ2R两种亚型,σR具有不同的组织分布、细胞功能和药理特征。σ1R是一种主要位于线粒体内质网的结构特殊的跨膜蛋白,可以和其他蛋白(如N-甲基-D-天冬氨酸和阿片受体)相互作用,调节细胞内蛋白的合成和活性,其配体拮抗剂可用于治疗精神疾病、疼痛、诱导多种肿瘤细胞凋亡。高水平的σ1R使前列腺癌细胞对TRAIL治疗具有更强的耐受性,σ1R在TRAIL诱导的Caspase激活中起着关键的作用;σ1R使人乳腺癌对TRAIL敏感,为TRAIL诱导肿瘤特异性杀伤的关键介质。课题组前期研究发现宫颈癌组织尤其是宫颈腺癌和宫颈癌细胞系Siha和Hela细胞中存在σ1R高表达,自主合成的σ1R配体化合物可显著抑制宫颈癌细胞的生长。本研究将探讨σ1R配体化合物、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导因子(TRAIL)诱导剂、σ1R降调对宫颈癌Siha、Hela细胞增殖、迁移、克隆、凋亡等生物学行为的影响。为宫颈癌的靶向治疗提供更多的思路和理论依据。材料与方法σ1R拮抗剂BD1063、σ1R激动剂Avex-73、TRAIL诱导剂TIC10。MTT比色法检测配体化合物对细胞增殖的影响、细胞划痕实验检测化合物对细胞迁移的影响、平板克隆形成实验检测化合物对细胞克隆形成能力的影响、流式细胞术检测化合物对细胞凋亡作用、Western Blot技术检测化合物作用后σ1R蛋白及凋亡蛋白的表达。构建σ1R载体质粒sh RNA及上调质粒转染Siha、Hela细胞后观察其对细胞增殖和σ1R蛋白及凋亡蛋白的表达。统计学分析所有数据均采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料数据用sx±表示,两组间比较采用t检验,多组间两两比较采用最小显著差数t检验(LSD-t检验),多组间比较采用单因素方差分析。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.MTT显示:σ1R拮抗剂BD1063及TRAIL诱导剂TIC10以浓度和时间依赖性抑制Siha、Hela细胞增殖(P0.01)。Siha、Hela细胞作用48h,BD1063的IC50值分别为47.45μmol/L和38.37μmol/L,TIC10的IC50值分别为30.86μmol/L和31.32μmol/L;2.BD1063对TRAIL增敏作用:6μmol/L的BD1063联合不同浓度TIC10,对细胞抑制效果显著高于单用TIC10(P0.01);3.化合物对细胞迁移能力的影响:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用24h后,Siha、Hela细胞迁移率均明显小于对照组(P0.01);4.化合物对细胞克隆形成能力的影响:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用2周后克隆形成率均明显小于对照组(P0.01);5.化合物对细胞凋亡的影响:48μmol/L BD1063和40μmol/L的TIC10作用48h后,细胞凋亡率高于对照组(P0.01);6.Western blot显示:BD1063联合TIC10作用后,σ1R表达水平降低,cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表达显著增高(P0.05);7.降调σ1R:σ1R的sh RNA质粒转染后均可显著抑制细胞增殖(P0.01),其中932质粒抑制效果最好;降调σ1R后联合TIC10作用48h,对Siha、Hela细胞的抑制率明显高于TIC10(P0.01);8.BD1063对Ha Cat细胞无明显增殖抑制作用;Avex-73和σ1R上调质粒对Siha、Hela、Ha Cat细胞无明显增殖抑制作用(P0.05)。结论1.σ1R拮抗剂BD1063和TRAIL诱导剂TIC10均呈浓度梯度和时间依赖性抑制Siha、Hela细胞增殖。2.BD1063和TIC10可抑制Siha、Hela细胞迁移;降低Siha、Hela细胞克隆形成率;增加Siha、Hela细胞凋亡。3.低浓度BD1063可增加Siha、Hela细胞对TIC10的敏感性。4.σ1R的sh RNA质粒转染可降低σ1R表达并增加Siha、Hela细胞对TIC10的敏感性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

16图 1 σ1R shRNA 和 A1826-2 上调质粒在宫颈癌细胞中的转染率A：σ1R shRNA 和 A1826-2 上调质粒转染 Siha、Hela 细胞 6h 后，转染率均达 60%左右；B：σ1R shRNA 和 A1826-2 上调质粒转染 Siha、Hela 细胞的转染率对比柱状图。

图 2 不同浓度 σ1R 拮抗剂 BD1063 对 Siha、Hela 细胞增值抑制率的比较A：BD1063 呈浓度和时间依赖性抑制 Siha 细胞的生长（P＜0.01）；B：BD1063 呈浓度和时间依赖性抑制 Hela 细胞的生长（P＜0.01）。表 4 不同浓度的 σ1R 拮抗剂 BD1063 对 HaCat 细胞增殖抑制率的比较（%，x ±s）化合物浓度（μmol/L） 样本数（n） 24h 48h 72h1.5 12 0.01±1.70 1.59±0.87 3.68±3.703 12 1.07±1.03 3.39±2.30 4.24±2.856 12 1.91±1.02 4.41±3.95 6.26±3.5212 12 2.27±1.30 4.36±3.84 6.99±2.7624 12 2.40±1.13 6.35±2.82 7.75±3.4648 12 3.41±1.48 7.33±2.85 8.78±3.1296 12 3.74±2.03 8.15±3.14 9.19±3.44192 12 3.67±1.92 7.97±3.13 8.72±3.29IC50值 — — —F — — —P — — —

2.4 σ1R 拮抗剂、TRAIL 诱导剂对宫颈癌细胞迁移能力的影响细胞划痕实验显示，48μmol/L BD1063 作用 Siha 和 Hela 细胞 24h 后，Siha细胞迁移率[（19.42±1.32）%]、Hela 细胞迁移率[（24.62±2.37）%]，均显著小于对照组 Siha[（41.34±2.45）%]、Hela[（39.42±9.06）%]，tSiha=19.28，PSiha＜0.01和 tHeLa=7.92，PHela＜0.01。40μmol/L TIC10 作用 24h 后，Siha 细胞迁移率[（17.19±1.67）%]、Hela 细胞迁移率[（20.08±3.51）%]，均显著小于对照组Siha（[41.34±2.45）%]和 Hela（[39.42±9.06）%]，tSiha=19.92，PSiha＜0.01 和 tHeLa=9.01，PHela＜0.01。见图 3。
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本文编号：2860999