子宫损伤后修复缺陷是导致女性不育、流产、早产、子宫破裂发生的主要原因之一,不仅破坏女性生殖能力,严重时甚至危及母儿生命安全。因此,促进子宫损伤的修复愈合对维持女性生殖健康有重要意义。然而,损伤修复期的人类子宫组织获取受限,这不仅影响子宫损伤修复及重塑机制相关研究的深入,也阻碍了子宫损伤性疾病临床诊治的进展,因此动物实验成为探索这一未知领域的研究工具。组织工程是一门以细胞生物学、材料科学与再生微环境相结合,进行体外或体内组织器官功能性修复、器官重构研究的新兴学科。组织工程的兴起为人体组织缺损导致的功能障碍提供了理想的治疗方案。近年来有关修复和再生的组织工程研究越来越多,其中胶原蛋白因良好的组织相容性、低免疫源性和易降解等生物学特性被推广和应用。采用胶原蛋白支架负载细胞或生物活性因子促进损伤组织修复也收到了满意的临床疗效。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)是一种具有多种生物学功能的细胞因子,近年来研究发现,LIF有效地促进了骨骼肌、神经和心肌等多种组织器官的再生和修复。而LIF在子宫组织表达丰富,子宫内膜腺上皮LIF的表达是子宫内膜接受胚胎着床不可或缺的分子;此外,LIF在子宫内膜间质细胞和子宫肌层均有表达,提示LIF可能具有促进子宫组织损伤修复的生物学功能。本研究对此进行了初步探索,研究第一部分,采用大鼠子宫壁全层损伤动物模型,将负载不同剂量LIF胶原支架移植至子宫壁全层损伤的缺损区域,与PBS胶原支架修复相比较。通过术后1-2周损伤区域修复变化的对比分析,探索LIF促进子宫损伤修复的可能性及有效剂量,通过对比分析术后1周大鼠子宫损伤修复局部的炎症细胞和炎症因子,研究LIF调控局部炎症反应与促进损伤修复的关系;研究的第二部分,采用胶原支架负载0.5μg LIF或等容量PBS修复大鼠子宫壁全层损伤,通过对比分析术后2-12周子宫组织结构修复和重塑改变,验证LIF促进子宫壁损伤修复的有效性;进一步通过妊娠实验对比分析修复子宫的功能差异。本研究发现和明确了LIF促进大鼠子宫损伤修复的生物学功能,为LIF应用于子宫损伤性疾病的临床治疗提供了动物实验基础。目的:1.通过移植负载LIF或PBS的胶原支架于大鼠子宫壁全层损伤模型的子宫缺损区域,对比观察不同浓度LIF或PBS对子宫损伤修复的效应,探索LIF修复子宫损伤的可行性及最佳剂量,并进一步对比研究LIF在损伤修复过程中的可能机制。2.采用负载LIF或PBS的胶原支架修复大鼠子宫壁全层损伤,通过术后12周的长期观察,明确LIF具有促进损伤子宫结构和功能修复的生物学功能。方法:1.参照本实验室前期建立的大鼠子宫壁全层损伤动物模型,在大鼠子宫体中段系膜对侧切除1.5 cm长、0.5 cm宽(相当于子宫周径2/3)子宫壁全层缺损。前期研究已证明,大鼠不能自然功能性修复该大小的子宫壁损伤。2.24只成年雌性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠随机分为4组:PBS/胶原支架对照组,0.25μg LIF/胶原支架组,0.5μg LIF/胶原支架组,1.0μg LIF/胶原支架组,子宫壁全层损伤后,分别将负载0.25μg、0.5μg、1.0μg LIF或PBS的1.5 cm×0.5cm胶原支架缝合于缺损区(LIF各组6只大鼠,12只子宫,n=12;PBS组6只大鼠,12只子宫,n=12,共48只子宫),术后2周对损伤子宫行大体解剖观察、HE和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色组织学观察,评估子宫壁的形态,计数胶原支架上的细胞和新生血管数量。IHC主要用于检测v WF(von-Willebrand-factor,v WF)的表达。3.10只雌性SD大鼠随机分为两组,包括LIF/胶原支架组5只(子宫损伤后,用负载0.5μg LIF的胶原支架缝合缺损),PBS/胶原支架组5只(用PBS浸润的胶原支架膜缝合缺损)(PBS:n=10;LIF:n=10)。术后1周,取损伤区域子宫组织,对损伤子宫组织切片进行HE、CD45的IHC和免疫荧光染色,对比两组炎症细胞变化;收集受损部位的子宫组织,提取总RNA并通过逆转录PCR和实时定量PCR分析检测修复组织内炎性细胞因子(IL-10,IL-12,IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1)m RNA水平。4.明确LIF修复损伤子宫的可行性及有效剂量后,48只雌性SD大鼠随机分为两组:包括LIF/胶原支架组(子宫损伤后,用负载0.5μg LIF的胶原支架缝合缺损),PBS/胶原支架组(用等容量PBS浸润的胶原支架缝合缺损)。分别在术后2周(PBS:n=12;LIF:n=12),4周(PBS:n=12;LIF:n=12),8周(PBS:n=12;LIF:n=12)和12周(PBS:n=12;LIF:n=12),进行子宫通畅实验和大体检查,通过组织切片IHC染色a平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,a-SMA)、细胞角蛋白7(Cytokeratin 7,CK7)评估子宫平滑肌和子宫内膜上皮再生情况。5.雌性SD大鼠25只分为两组,包括LIF/胶原支架组15只,PBS/胶原支架组10只(LIF:n=30;PBS:n=20),子宫壁全层损伤后采用两种不同方法修复,观察满8周,然后将两组动物与雄性SD大鼠配对,在妊娠15-19日剖视并计数妊娠子宫数、子宫壁损伤处的着床情况和胚胎数以评估LIF对损伤子宫妊娠能力的影响。结果:1.术后短期对比观察:(1)子宫损伤局部细胞化和血管再生:术后2周,各组损伤区域未降解的胶原支架中可见细胞浸润,局部无明显炎症反应,LIF各组的胶原支架内细胞数明显多于PBS组,差异有统计学意义(P0.001);IHC血管密度:0.25μg和0.5μg LIF组血管密度均明显高于PBS组(P0.001)。(2)胶原支架内炎症细胞和炎性因子变化:术后1周,HE染色显示LIF和PBS两组胶原支架均未降解,未发现周围组织的排斥反应,此时损伤区域胶原支架中均见炎性细胞浸润。CD45免疫组化和免疫荧光染色显示,LIF组CD45阳性细胞(炎症细胞)浸润数量少于PBS组,LIF组CD45的AOD值较PBS组减少,差异有统计学意义(P0.01)。损伤子宫组织内炎性因子IL-10,IL-12,IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1m RNA表达水平检测结果:LIF/胶原支架修复子宫组织中IL-10的表达水平较对照组上调2.74倍(P0.01);而IL-12的表达下调2.09倍(P0.05)。两组IL-6,IL-1β,TNF-α和TGF-β1的表达水平差异无统计学意义(P0.05)。2.术后长期对比观察:(1)子宫愈合大体外观:术后8周和12周,LIF/胶原支架修复手术区域外观上与周围组织相似,虽然通畅实验提示两组子宫均无梗阻,但PBS/胶原支架组修复区域可见瘢痕及局部凹陷。(2)子宫平滑肌再生修复:LIF组术后8、12周α-SMA阳性面积比例与术后2周比较均显著增加,差异有统计学意义(P0.01);术后8和12周,LIF/胶原支架组的α-SMA阳性面积比例均显著高于同期PBS/胶原支架组,差异有统计学意义(P0.001)。(3)子宫内膜再生修复:各组术后4周至12周子宫内膜厚度无明显变化,组间比较,LIF组子宫内膜厚度较PBS组增加,但差异无统计学意义(P0.05);术后8周和12周,LIF组的子宫内膜再生腺体数量明显高于PBS组,差异有统计学意义(P0.001)。3.妊娠实验结果两组平均妊娠率和每个子宫妊娠的平均胚胎数目比较,LIF/胶原支架组高于PBS/胶原支架组,平均妊娠率(86.67%vs 60.00%)和平均胚胎数(3.63±0.34vs 2.35±0.51),差异均有统计学意义(P0.05)。LIF/胶原支架组中有10个子宫(10/30)在修补区域有胚胎着床,而PBS/胶原支架组在子宫手术区域仅有3个子宫(3/20)有胚胎着床,整个妊娠期两组均无子宫破裂发生。结论:1.5×0.5cm胶原支架负载LIF 0.5μg能够促进大鼠子宫壁全层损伤修复,在损伤修复早期,LIF主要表现出促进损伤区域的细胞化、促进局部血管再生功能,LIF的作用呈现剂量依赖性;LIF对子宫肌层和子宫内膜腺体再生修复作用显著;LIF修复的子宫组织结构接近正常子宫,能够接受胚胎和完成妊娠,妊娠率和胚胎数显著提高;在子宫损伤修复的炎症期,LIF抑制子宫损伤局部炎细胞浸润和促炎因子释放,同时促进抑炎因子在损伤组织的表达,对损伤后炎症反应的调控可能是LIF促进子宫壁全层损伤修复的重要机制之一。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R711
【部分图文】：
图 1 组织损伤修复 3 阶段研究报道了一种新型大鼠子宫壁重建模型，并采用胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）
个正常动情周期（4-5 天）的雌鼠纳入实验研究，并于动情间期进行手术处理。实验鼠共计 24 只(48 个子宫)，每组各 6 只（12 个子宫）。图2 雌鼠动情周期阴道涂片镜下观察我们采用前期建立的大鼠子宫壁全层损伤的动物模型，切除大鼠子宫壁1.5cm 长×0.5cm 宽(子宫周径 1/2)，保留系膜侧的全层缺损，每个子宫 1 个手术缺损创面，使用相应大小的胶原支架缝合到大鼠子宫壁缺损区域，见示意图（图3），前期实验室研究结果已经证实了胶原支架适用于细胞的粘附和维持组织的固有形态，作为子宫再生细胞外基质的适用性。
使用相应大小的胶原支架缝合到大鼠子宫壁缺损区域，见示意图（图3），前期实验室研究结果已经证实了胶原支架适用于细胞的粘附和维持组织的固有形态，作为子宫再生细胞外基质的适用性。
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