食蟹猴超数排卵及shank3基因敲除胚胎初步研究

发布时间：2017-04-05 08:18

  本文关键词：食蟹猴超数排卵及shank3基因敲除胚胎初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自闭症也称为孤独症,是由于神经系统失调而导致的发育障碍,自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)包括一系列神经发育疾病,主要表现出三种特征：社会交往和语言交流障碍,重复刻板的行为和狭隘兴趣。Shank3基因的突变被认为是ASD中神经发育和神经行为不良的重要原因。在本研究中,我们将探讨使用新的基因编辑技术(gene editing technology) ——CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9),结合优化了的食蟹猴辅助生殖技术(assisted reproductive technologies, ARTs),初步研究制备携带与人类遗传突变有关的自闭症基因修饰食蟹猴。本实验进行了食蟹猴重复超排研究。使用重组人促卵泡激素(recombinant human follicular stimulation hormone, rhFSH)对食蟹猴全年进行重复超排。对128只成年食蟹猴每天早晚两次肌肉注射1.375μg rhFSH,连续8天,第9天肌肉注射83.3μg hCG (human chorionic gonadotropin, hCG)。首次超排研究发现,在一年的春(1-3月)夏(4-6月)秋(7-9月)冬(10-12月)四个季节中,卵巢应答和卵巢收集均无显著性差异。经过首次超排后,第一次月经周期变短,第二次月经周期则变长,第三(28.5±2.8天)、四次月经周期(27.8±3.4天)则恢复到与超排前月经周期(28.6±3天)一致。因此间隔2、3、4个月经周期对食蟹猴进行再次超排,卵巢应答和卵巢收集均与第一次超排结果相似,均无显著性差异。首次超排结果可以预计后面两次重复超排,经过前四次重复超排,较好应答的食蟹猴卵巢收集均无显著性差异,每次超排取卵数分别为39.8±24.3,33.8±11.9,35.4±26.9,37.4±20.4。但是第五次重复超排效果则比前四次显著降低。总之,食蟹猴全年任何时期都可以启动超排,间隔两个月经周期可以再次进行超排,每只食蟹猴可以至少重复四次超排。本研究使用CRISPR/Cas9基因修饰载体对食蟹猴胚胎基因组的shank3基因进行靶向敲除。通过对食蟹猴1细胞胚胎共注射Cas9 mRNA和sgRNA,经体外培养后,得到3枚桑椹胚或囊胚,通过T7EN1酶切实验以及sanger测序均检测到位点特异性修饰,说明CRISPR/Cas9工程核酸酶可以有效地对食蟹猴胚胎进行基因修饰,为后期研制shank3基因敲除食蟹猴提供重要佐证。
【关键词】：自闭症 shank3 食蟹猴 超数排卵 CRISPR/Cas9
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8;Q78
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 主要缩略词12-13
• 第一章 引言13-33
• 1.1 自闭症谱系障碍概述13-16
• 1.1.1 Shank3基因13-14
• 1.1.2 SHANK3蛋白14-15
• 1.1.3 Shank3基因敲除小鼠模型研究概述15-16
• 1.2 CRISPR技术的概述16-20
• 1.2.1 CRISPR的基本结构和工作原理17-18
• 1.2.2 CRISPR体系在基因修饰中的作用18-20
• 1.3 猕猴辅助生殖技术的概述20-26
• 1.3.1 精液采集20-21
• 1.3.2 超数排卵21-24
• 1.3.3 胚胎的获取24
• 1.3.4 胚胎培养24-25
• 1.3.5 胚胎移植25-26
• 1.4 遗传修饰灵长类动物26-30
• 1.5 本论文的研究目的和技术方案30-33
• 第二章 食蟹猴超数排卵的研究33-45
• 2.1 材料和方法33-36
• 2.1.1 实验主要仪器33
• 2.1.2 实验主要试剂及配方33-34
• 2.1.3 实验动物及饲养条件34
• 2.1.4 月经周期观察34
• 2.1.5 超数排卵34
• 2.1.6 腹腔镜取卵34-35
• 2.1.7 卵母细胞收集35-36
• 2.1.8 统计分析36
• 2.2 结论36-42
• 2.2.1 季节对食蟹猴超数排卵的影响36-37
• 2.2.2 间隔不同月经周期对重复超排的影响37-39
• 2.2.3 多次重复超排对卵巢应答的影响39-42
• 2.3 讨论42-45
• 第三章 食蟹猴胚胎shank3基因靶向敲除的研究45-60
• 3.1 材料和方法45-55
• 3.1.1 实验主要仪器45
• 3.1.2 主要试剂及配方45-47
• 3.1.3 直肠电刺激采精47-48
• 3.1.4 基因修饰载体体系优化与筛选48-49
• 3.1.5 胚胎操作49-51
• 3.1.5.1 胚胎获取——ICSI49
• 3.1.5.2 载体注射49-50
• 3.1.5.3 胚胎培养50-51
• 3.1.5.4 收集胚胎51
• 3.1.6 分子实验操作51-55
• 3.2 结论55-58
• 3.2.1 CRISPR有效地诱导食蟹猴胚胎shank3基因打靶55-57
• 3.2.2 Shank3基因敲除胚胎sanger测序57-58
• 3.3 讨论58-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-68
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录68

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