含铜宫内节育器致子宫内膜异常出血的机制研究

发布时间：2020-11-03 20:05

　　 第一部分:含铜宫内节育器(Copper Intrauterine Device,Cu-IUD)对猕猴子宫内膜的影响【目的】构建猕猴含铜宫内节育器(Copper Intrauterine Device,Cu-IUD)置入模型,分析置器后不同月经周期猕猴宫腔液Cu~(2+)浓度、血清雌孕激素水平、子宫内膜出血相关因子的表达水平及组织病理变化,为研究Cu-IUD致子宫内膜异常出血的机制奠定基础。【方法】选取成年雌性猕猴12只,其中Cu-IUD组9只,对照组3只。Cu-IUD组通过手术置入Cu-IUD(按人与动物体重剂量折算方法,以正常人体置入的宫内节育器的含铜表面积220 mm2为依据计算实验所需的材料大小),对照组仅作子宫切口处理。术后待观察到猕猴的一个完整的月经周期后,分别在下一个月经周期的月经期(月经周期第2天)、增生期(月经周期第10天)和分泌期(月经周期第20天)收集两组猕猴的宫腔冲洗液、动脉血及子宫内膜组织。其中,Cu-IUD组不同月经周期各取3只猕猴,对照组不同月经周期各取1只猕猴。通过火焰原子吸收光谱法(Flame atomic absorption spectrometry,FAAS)检测两组猕猴不同月经周期宫腔冲洗液中的Cu~(2+)浓度;苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)分析子宫内膜损伤情况;酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测雌孕激素水平;RT-q PCR及Western Blot分别检测环氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOs)的表达。【结果】FAAS结果显示Cu-IUD组不同月经周期Cu~(2+)浓度均明显高于对照组(P0.05),其中,月经期差异最大;HE结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜损伤较对照明显,增生期和分泌期未见明显差异;ELISA结果显示Cu-IUD组不同月经周期雌孕激素水平与对照组相比均无明显差异;Cu-IUD组月经期子宫内膜COX-2、VEGF、NOS m RNA及蛋白的表达水平明显高于对照组(P0.05),增生期和分泌期未见明显差异。【结论】置入Cu-IUD后猕猴月经期宫腔液中Cu~(2+)的释放显著增加,并导致月经期子宫内膜损伤加重及出血相关因子的表达水平增高,但不影响血清雌孕激素水平。第二部分:Cu-IUD致猕猴子宫内膜损伤修复相关信号通路的初步探索【目的】研究置入Cu-IUD后子宫内膜组织中基因表达谱的变化,并初步探索其参与的子宫内膜损伤修复相关的信号通路。【方法】分别提取Cu-IUD组和对照组不同月经周期子宫内膜组织的RNA,进行二代高通量测序,筛选两组月经期差异表达的m RNA并应用生物信息学方法分析这些差异m RNA参与的生物学过程及分子功能;RT-q PCR对上述部分差异m RNA进行验证并筛选靶标m RNA;Western Blot对关键靶标m RNA进一步验证并通过Western Blot及免疫组化检测其相关的上、下游基因的表达水平,探究Cu-IUD致异常出血可能涉及的通路。【结果】高通量测序结果显示与对照组相比,Cu-IUD组月经期子宫内膜共有953个差异表达的基因,其中上调的有425个,下调的有528个;生物信息学分析结果显示上述部分基因参与了出血损伤、Cu~(2+)代谢、组织修复等相关过程,通过RT-q PCR验证得到的靶标差异基因为:MMP1、MMP2、MMP9、MMP14、MT1A、MT1L、TGF-β1、TGF-β3;Western Blot结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中MMP1、MMP2、MMP9、MMP14的蛋白表达水平均显著高于对照组(P0.05),MT的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05),TGF-β1的蛋白表达水平明显低于对照组(P0.05),上述结果与RT-q PCR一致;此外,Western Blot及免疫组化结果显示Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中TSP1(TGF-β上游基因)的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05),P-SMAD2/3((TGF-β下游基因))的蛋白表达水平显著低于对照组(P0.05);Cu-IUD组月经期子宫内膜组织中P-P65(磷酸化NF-κB,MMPs上游基因)的蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05)。【结论】Cu-IUD可显著影响子宫内膜组织中出血损伤、Cu~(2+)代谢、组织修复等相关基因m RNA及蛋白的表达水平,且可能参与子宫内膜损伤修复的相关信号通路:NF-κB/MMPs(损伤通路)及TSP1/TGF-βs/SMAD2/3(修复通路)。第三部分:NF-κB及TGF-β信号通路参与Cu-IUD致人子宫内膜上皮细胞(HEEC)损伤/修复的研究【目的】体外探索NF-κB及TGF-β信号通路参与Cu-IUD致子宫内膜损伤/修复的机制。【方法】选择HEEC作为研究对象,培养液中添加Cu~(2+)进行处理,通过CCK-8法检测Cu~(2+)处理组和未处理组的细胞活力,确定合适的Cu~(2+)浓度,并通过划痕实验确定Cu~(2+)对HEEC损伤修复是否有影响;通过Western Blot及细胞免疫荧光检测Cu~(2+)处理组和未处理组中损伤修复相关基因MMP1、MMP2、MMP9、TGF-β1、P-P65、P65、P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3及TPS-1蛋白表达水平的差异;在上述基因的表达水平存在差异的情况下,通过干扰P-P65或者TGF-β1探索Cu-IUD致HEEC损伤修复的相关通路:(1)损伤通路:在Cu~(2+)处理的情况下,实验组HEEC培养液中添加不同浓度的NF-κB抑制剂(QNZ),Western Blot检测P-P65、MMP9的蛋白表达水平,划痕实验检测最适浓度下HEEC的损伤修复情况,(2)修复通路:在Cu~(2+)处理的情况下,实验组HEEC培养液中添加不同浓度细胞因子TGF-β1,Western Blot检测P-SMAD2、SMAD2、P-SMAD3、SMAD3的蛋白表达水平,划痕实验检测最适浓度下HEEC的损伤修复情况。【结果】5μg/ml的Cu~(2+)处理HEEC 48小时后,细胞的增殖活力大约为对照组的50%,且划痕实验结果显示5μg/ml的Cu~(2+)处理修复率显著低于对照组(P0.05);Cu~(2+)处理HEEC后MMP1、MMP2、MMP9、P-P65的蛋白表达水平明显高于对照组(P0.05),TGF-β、P-SMAD2,P-SMAD3及TSP1的表达水平明显低于对照组(P0.05);在Cu~(2+)处理的情况下,添加QNZ(100 n M)后,P-P65、MMP9的蛋白表达水平明显降低,且HHEC的损伤修复率显著提高;添加TGF-β1(10 ng/ml)后,P-SMAD2,P-SMAD3的蛋白表达水平明显升高,且HHEC的损伤修复率显著提高。【结论】Cu~(2+)可引起HHEC中MMPs、P-P65蛋白表达水平的上调及TGF-β的蛋白表达水平的下调,且可能通过激活NF-κB/MMP9信号通路(损伤通路)及抑制TSP1/TGF-β/SMAD2/3信号通路(修复通路)从而抑制HEEC的增殖修复作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R711
【部分图文】：

以上结果均提示置器后月经期 Cu2+代谢速率（损伤保护性因素）降上所述，目前对置入 Cu-IUD 后子宫异常出血的机制研究主要集中在的子宫内膜损伤。然而，子宫内膜的周期性变化本身就是损伤与增殖。因此，单从损伤角度，仍不能完整解释异常出血的发生机制。孕激素与损伤/增殖修复宫内膜上皮的生长受雌、孕激素的调控呈现周期性变化，月经规则入 Cu-IUD 后，其血清激素水平不会随着 IUD 的置放而发生改变[21]。Cu-IUD导致的子宫异常出血等不良反应与激素调控的子宫内膜周期不存在直接的相关性。且置器后主要影响的是月经期，表现为出血量延长等，而在增生期和分泌期很少见到异常出血的发生。于以上事实，我们推测：置器后受激素调控的子宫内膜周期性变化 Cu2+的刺激，子宫出血的模式发生改变（置器后月经周期中子宫内膜出血关系图 3）。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3 实验结果1 放置 Cu-IUD 后猕猴不同月经周期宫腔液中 Cu2+的浓度我们采用 FAAS 法测定不同月经时期的宫腔溶液中 Cu2+的浓度，结果显u-IUD 组不同月经周期宫腔冲洗液中 Cu2+的浓度均明显高于对照组（P＜0.0月经期差异最大。此外，Cu-IUD 组中月经期宫腔冲洗液中的 Cu2+浓度明显增生期和分泌期高，且差异有统计学意义（P＜0.05）（图 4）。上述结果表入含铜宫内节育器后，月经期 Cu2+释放明显增加，很可能是导致月经出血的直接原因。

图 2 置入 Cu-IUD 后对不同月经周期子宫内膜形态的影响（标尺=100 μm）3.3 放置 Cu-IUD 后对猕猴不同月经周期雌孕激素的影响我们通过 ELISA 的方法分别检测 Cu-IUD 组和对照组猕猴血清激素的改变。结果显示Cu-IUD组猕猴不同月经周期血清雌孕激素水平与对照组相比差异无统计意义（P＞0.05）（表 1）。结果提示含铜共内节育器并不是通过影响激素的变化而导致月经期子宫内膜出血加重的。表 1. Cu-IUD 对雌性猕猴不同月经周期血清激素的影响（均数±标准差）PhaseE2 (pg/ml) P (ng/ml)Cu Control Cu ControlMenstrual 59.3±21.1 68.3±25.9 0.457±0.318 0.447±0.17Proliferative 107±16.5 112±26.2 0.301±0.121 0.327±0.13Secretory 131±22 137.3±23.4 7.837±4.016 6.887±2.175
【参考文献】

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本文编号：2869040