一、SALL4在恶性滋养细胞肿瘤中的功能机制研究以及基于CTC平台的临床应用 二、熔解曲线分析在B细胞淋巴瘤IGH基因重

发布时间：2020-11-06 01:09

　　 本论文主要分两部分,第一部分旨在探究干细胞因子SALL4对恶性滋养细胞功能的影响并基于循环滋养细胞水平探究恶性滋养细胞肿瘤患者中SALL4的表达情况。培养胎盘绒毛膜癌来源的SALL4高表达恶性滋养细胞系JAR,用慢病毒表达载体分别建立SALL4稳定敲低和SALL4稳定过表达的恶性滋养细胞。CCK-8细胞增殖实验、Transwell体外侵袭和迁移实验结果显示SALL4敲低显著减弱了恶性滋养细胞JAR的增殖、侵袭迁移能力,而SALL4过表达则进一步增强了 JAR的增殖、侵袭迁移能力。采用流式细胞术分析SALL4敲低JAR以及阴性对照细胞的周期分布,结果显示SALL4敲低的JAR细胞发生了 G0/G1期阻滞。Western blot和实时荧光定量PCR结果显示SALL4敲低的恶性滋养细胞中c-Myc、MMP2、CCND1、β-catenin的蛋白和RNA表达均下调。采用微过滤结合RNAFISH法进行CTC富集分析并进一步检测单个CTC中SALL4表达,结果显示恶性滋养细胞肿瘤患者CTCs总数、混合型CTCs和间质型CTCs数量要显著高于正常早孕组,ROC分析结果显示三个指标最大曲线下面积(AUC)分别为0.776(p=0.001)、0.719(p=0.012)和0.695(p=0.025)。SALL4高表达CTCs在正常早孕组和良性滋养细胞疾病组中无检出,而在恶性滋养细胞肿瘤患者中检出率达31.6%(6/19)。因此我们得出结论,SALL4在恶性滋养细胞中具有促癌作用,并可能通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路调控c-Myc、CCND1、MMP2的表达,发挥促进绒癌细胞增殖、侵袭转移的作用。本研究首次在滋养细胞疾病患者中研究CTC在恶性滋养细胞肿瘤辅助诊断中的应用价值,表明CTCs在恶性滋养细胞肿瘤和正常早孕人群中的数量有显著差异,并具有较好的诊断效能,提示其可作为β-hcg的补充标志物。基于CTCs水平首次在恶性滋养细胞肿瘤患者中发现SALL4高表达CTCs,为SALL4参与恶性滋养细胞肿瘤发生发展提供新的临床线索。第二部分研究中我们将BIOMED-2引物系统中FR2家族引物应用到熔解曲线分析,联合FR2和FR3家族引物检测免疫球蛋白重链(IGH)基因重排,并评价改良方法在B细胞淋巴瘤中的临床应用。收集40例B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的存档石蜡包埋组织、31例反应性淋巴细胞增生患者的石蜡包埋组织,合成BIOMED-2系统中针对IGH重排检测的FR2家族引物七条和FR3家族引物七条以及共同下游引物JH一条,采用含SYBR Green染料的PCR预混体系通过LightCylcer荧光定量PCR仪检测,并用传统BIOMED-2体系聚丙烯凝胶(PAGE)电泳技术和毛细管电泳技术进行验证。结果显示,31例反应性增生标本检测结果均为阴性,特异性为100%。改良方法联合FR2和FR3两家族引物在40例B淋巴瘤石蜡包埋组织标本中共检测出28例克隆性重排,敏感性为70%(28/40),比单独使用FR3家族引物灵敏度提高12.5%;同时采用PAGE法对40例B淋巴瘤石蜡包埋组织标本进行检测,结果显示熔解曲线分析和PAGE法的一致性为95%;对2例PAGE法检测无法判读结果而熔解曲线分析检测为阳性的样本进行毛细管基因扫描,结果显示这两例样本均为阳性,与熔解曲线分析检测结果一致;将Ramos细胞系用反应性增生DNA倍比稀释后检测,显示改良方法的最低检测限可达3.125%。综上所述,改良熔解曲线检测IGH基因重排,结果可靠,检测快速灵敏、通量较高,且有效避免了产物暴露造成的污染,有望成为克隆性重排检测的新选择。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

前言??细胞肿瘤是指胚胎外胚层滋养细胞发生恶变而形成的肿］，继发于妊娠，包括侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌、胎盘部位及上皮样滋养细胞肿瘤（ＥＴＴ），?ＰＳＴＴ及ＥＴＴ临床罕见，和绒毛膜癌。滋养细胞疾病在不同国家发病率差异较大［Ｐａｌ、新西兰和欧洲，葡萄胎、绒癌的发病率分别为０．５７－１．１次妊娠，在东南亚、日本等国家分别为２．０／１０００次妊娠、３．３来各地区发病率均呈下降趋势［Ａｔｒａｓｈ?ｅｔ?ａｌ．，１９８６，?Ｂｒｉｎｔｏｎ?００３］。我国大规模调查数据显示良性葡萄胎发展为侵袭性为２０％左右［石一复，２００６］，绒癌５０％来源于葡萄胎，２５％月妊娠，其余源于异位妊娠之后［史常旭，２００６］，也有报道性葡萄胎发展而来［杜鹏辉，２００５］，侵袭性葡萄胎则均继发?

?表１－１?ＲＮＡ?ＦＩＳＨ探针及标记焚光素???基因类型?标记荧光素?探针靶基因?显微成像图颜色??上皮性标志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?５９４?ＥＰＣＡＭ?红色信号点??ＣＫ８??ＣＫ１８???ＣＫ１９???间质性标志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?４８８?ＶＩＭＥＮＴＩＮ?绿色信号点???ＴＷＩＳＴ???白细胞标志物?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?７５０?ＣＤ４５?白色信号点??附加探针?Ａｌｅｘａ?Ｆｌｕｏｒ?６４７?ＳＡＬＬ４?紫色信号点??３０??

、敲低ＳＡＬＬ４表达使ＪＡＲ细胞增殖能力、侵袭、迁移能力减弱??我们首先对绒癌细胞系ＪＡＲ进行蛋白荧光免疫染色观察其本底ＳＡＬＬ４表达情??况，结果发现，ＪＡＲ细胞ＳＡＬＬ４蛋白表达为阳性（图１－４）。我们用慢病毒包装质??粒ｐＨＲ，－ＣＭＶ－８．９ＡＶＰＲ、ｐＨＲ，－ＣＭＶ－ＶＳＶＧ以及载体质粒ｓｈＲＮＡｐＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７（图??１－５Ａ）构建阴性对照和ｓｈ－ＳＡＬＬ４的慢病毒表达载体，再经慢病毒侵染ＪＡＲ细胞，??建立稳定表达细胞系ｓｈ－ＳＡＬＬ４－ＪＡＲ和ｓｈ－ＮＣ－ＪＡＲ。慢病毒插入序列经过测序验证，??序列如下：??ｓｈ－ＳＡＬＬ４：?５＇－ＣＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡ－３＇??ｓｈ－ＮＣ：?５＇－ＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ－３＇??采用ＲＴ－ｑＰＣＲ以及蛋白免疫印迹验证ｓｈ－ＳＡＬＬ４－ＪＡＲ的ＳＡＬＬ４表达在ＲＮＡ??水平和蛋白水平均显著下调（图１－６）。采用ＣＣＫ８细胞增殖实验对比ＳＡＬＬ４干扰??细胞与阴性对照细胞的增殖能力，结果显示ＳＡＬＬ４干扰后，ＪＡＲ细胞的增殖能力??显著减弱（图１－７）。采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭试验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移试验对比ＳＡＬＬ４干??扰细胞与阴性对照细胞的侵袭转移能力，结果显示，ＳＡＬＬ４干扰后细胞的侵袭能??力和转移能力都显著减弱（图１－８）。??阴忭对照?ｊＡＲ细胞??由图可见，正常人白细胞（阴性对照）ＳＡＬＬ４表达为阴性，ＪＡＲ细胞ＳＡＬＬ４??表达阳性??图１－?４?ＪＡＲ细胞ＳＡＬＬ４免疫荧光染色??３５??
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 蔡艳;薛艳;安瑞芳;;妊娠滋养细胞疾病中EMT相关蛋白CK-18、波形蛋白的表达及意义[J];四川大学学报(医学版);2014年06期

2 徐洁;薛艳;曾宪玲;安瑞芳;;妊娠滋养细胞疾病中EMT相关蛋白CK19和N-cad表达的研究[J];现代妇产科进展;2014年07期

3 宋泓;罗新;;晚期妊娠合并绒癌1例报告[J];中国实用妇科与产科杂志;2013年05期

4 马冬捷;张志庸;向阳;万希润;肖雨;李单青;秦应之;;妊娠绒毛膜癌胸腺转移一例[J];中华临床医师杂志(电子版);2012年13期

5 李小秋;李甘地;高子芬;周小鸽;朱雄增;;中国淋巴瘤亚型分布:国内多中心性病例10002例分析[J];诊断学理论与实践;2012年02期

6 刘凤英;邓玉屏;聂妹芳;蒋珊;;妊娠合并绒毛膜癌3例[J];实用妇产科杂志;2012年01期

7 吴若淇;乔纯;童奕;葛峥;张建富;吴雨洁;仇海荣;王智;刘澎;;非霍奇金淋巴瘤患者免疫球蛋白及T细胞受体基因重排研究[J];中华血液学杂志;2012年01期

8 周鑫;夏欣一;黄宇烽;;循环内皮细胞的检测及其在肿瘤临床中的应用进展[J];医学研究生学报;2010年05期

9 郑锦霞;李英勇;;妊娠滋养细胞疾病相关研究进展[J];国外医学(计划生育/生殖健康分册);2007年05期

10 石一复;李娟清;;葡萄胎恶变的研究[J];实用肿瘤杂志;2006年06期

相关硕士学位论文 前1条

1 马丹丹;Twist基因诱导绒癌细胞上皮—间质转化的研究[D];河北医科大学;2015年

本文编号：2872453