孕哺期轻度碘缺乏及补碘对仔鼠小脑运动协调性的影响及机制研究

发布时间：2020-11-06 03:49

　　 目的:碘是合成甲状腺激素(thyroid hormone,TH)的必备原料,TH对胎儿生长发育至关重要。母体碘缺乏会造成子代神经发育损害、运动障碍和认知缺陷。目前,在许多国家(包括一些发达国家),孕哺期的妇女仍然处于轻度碘缺乏的风险之中。轻度碘缺乏是造成母体及胎儿低甲状腺素血症的最常见原因。低甲状腺素血症是指血清游离甲状腺素(free thyroxine,FT_4)水平降低,而促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)和游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT_3)的水平没有改变。研究表明,对孕哺期重度碘缺乏的母亲补碘是有益的,而对于轻度碘缺乏者是否应该补碘还没有确切依据。一些流行病学研究显示,对母亲进行补碘可能会降低子代认知和行为发育损害发生的危险性。然而,又有另外一些研究表明,补碘与儿童神经发育的损害相关。因此,孕哺期轻度碘缺乏的母亲是否应该补碘仍然存在争议。碘合成的TH是正常小脑功能所必需的激素。小脑维持机体平衡,调控运动协调功能。浦肯野细胞是小脑唯一传出神经元,它的树突长度缩短,分支减少或细胞器形态发生改变将导致动物行为学实验完成度下降,运动协调功能受损。运动协调性由兴奋性突触后慢电流(slow excitatory postsynaptic current,sEPSC)调控。sEPSC由浦肯野细胞中Ⅰ型代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor type1,mGluR1)及其下游一系列蛋白构成的信号通路介导。目前,母体孕哺期轻度碘缺乏及补碘是否影响子代小脑浦肯野细胞器形态及树突分支复杂性尚不明确,其对子代运动协调功能及相关的mGluR1信号通路的影响仍亟待回答。因此,本研究通过给予母鼠碘缺乏饲料和含不同浓度碘化钾的去离子水,建立轻度碘缺乏及补碘模型。探讨孕哺期轻度碘缺乏及补碘是否影响子代小脑浦肯野细胞超微结构及树突形态,进而影响运动协调功能。以期从行为学、形态学及分子生物学方面阐述孕哺期轻度碘缺乏及补碘对子代小脑发育及运动协调性的影响及相关机制。实验方法:1、实验动物与分组。健康2月龄雌性Wistar大鼠60只,按体重随机分成对照组、轻度碘缺乏组、补碘组和重度碘缺乏组。各组均给予碘缺乏地区粮食所配制的饲料,饮用含不同浓度碘化钾的去离子水。雌鼠每日总碘摄入量分别为7.0μg/d、3.0μg/d、3.0μg/d和1.5μg/d。大鼠饲养三个月后,按照雌鼠与雄鼠2:1合笼,从母鼠妊娠(gestational day,GD)0天开始至仔鼠出生后(postnatal day,PN)21天,补碘组雌鼠总碘摄入量上调至7.0μg/d。其它三组饮食饮水情况同前。2、动物血清TH和TSH水平测定。于GD0,对母鼠尾静脉采血,并分别于PN14和PN21时对仔鼠进行心脏采血,离心机3000 rpm,10 min离心。采用固相化学免疫发光法测定血清中FT_4、FT_3和TSH水平。3、母鼠尿碘水平测定。分别于母鼠GD0、GD13和GD19用代谢笼收集尿液,采用过硫酸铵消化—砷铈催化分光光度法测定尿液中碘含量。4、仔鼠行为学实验。于PN14,对仔鼠进行前肢握力实验,记录仔鼠掉落地面的时间。于PN21时分别进行平衡木和旋转杆实验,记录仔鼠通过平衡木及从旋转杆上掉落所需时间。5、仔鼠小脑浦肯野细胞树突的形态学研究。分别取PN14和PN21仔鼠小脑组织进行Golgi-Cox染色后,在显微镜下观察浦肯野细胞树突形态。用ImageJ软件追踪小脑浦肯野细胞树突轨迹,测量浦肯野细胞树突总长度。用Sholl分析方法分析树突分支复杂程度。6、仔鼠小脑浦肯野细胞电镜检测。取各组PN14时仔鼠小脑组织,迅速移入固定液中,经脱水、包埋、切片、染色后,采用透射电镜观察小脑浦肯野细胞核及细胞器的改变。7、仔鼠小脑运动协调性相关蛋白的测定分析。分别于PN14和PN21时,对各组仔鼠断头取小脑,采用Western Blot方法测定各组仔鼠小脑Gαq、PLD1、TRPC3和mGluR1的蛋白表达水平。全自动凝胶成像系统拍照,用ImageJ软件测量各条带灰度值。8、仔鼠小脑浦肯野细胞mGluR1和TRPC3免疫荧光测定分析。分别取PN14和PN21仔鼠,灌流固定小脑,包埋,制作石蜡切片,观察小脑浦肯野细胞mGluR1和TRPC3的荧光表达情况。9、统计分析。所有数据均使用软件SPSS17.0进行分析。计量数据表示为mean±SEM。采用单因素方差分析比较各组间差异。当数据有统计学差异时,使用SNK法进行两两比较。当P0.05时,认为有统计学差异。结果:1、孕哺期轻度碘缺乏及补碘影响TH和TSH的表达。在母鼠GD0、仔鼠PN14和PN21,轻度碘缺乏组与对照组相比FT_3和TSH水平无统计学差异(P0.05);补碘组FT_3和TSH水平与对照组和轻度碘缺乏组相比均无统计学差异(P0.05)。轻度碘缺乏组各时间点FT_4水平均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。在GD0,补碘组母鼠FT_4水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);与轻度碘缺乏组相比没有统计学差异(P0.05)。在PN14和PN21,补碘组仔鼠与对照组相比FT_4水平无统计学差异(P0.05),但高于轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。在各时间点,重度碘缺乏组FT_4和FT_3均分别低于对照组和轻度碘缺乏组,而TSH水平均高于对照组和轻度碘缺乏组,差异均有统计学意义(P0.05)。2、孕哺期轻度碘缺乏及补碘影响尿碘浓度。轻度碘缺乏组母鼠孕早期、孕中期和孕晚期尿碘水平均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。补碘组母鼠孕早期尿碘水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.05),与轻度碘缺乏组相比没有统计学差异(P0.05);孕中期和孕晚期尿碘水平与对照组相比均无统计学差异(P0.05),但均高于轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。重度碘缺乏组母鼠各时期尿碘水平均低于对照组和轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。3、孕哺期轻度碘缺乏及补碘影响仔鼠小脑运动协调性。在PN14前肢握力实验、PN21旋转杆实验和平衡木实验中,轻度碘缺乏组仔鼠的运动协调性均比对照组差,差异有统计学意义(P0.05)。补碘组仔鼠的运动协调性与对照组相比均没有统计学差异(P0.05),但均好于轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。重度缺乏组仔鼠的运动协调性分别比对照组和轻度碘缺乏组差,差异有统计学意义(P0.05)。4、孕哺期轻度碘缺乏及补碘影响仔鼠小脑浦肯野细胞树突形态。在PN14和PN21,轻度碘缺乏组仔鼠小脑浦肯野细胞树突总长度及分支复杂程度均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。补碘组仔鼠小脑浦肯野细胞树突总长度与对照组相比均没有统计学差异(P0.05),树突总长度及分支复杂程度均高于轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。重度缺乏组各时间点仔鼠小脑浦肯野细胞树突总长度均分别低于对照组和轻度碘缺乏组,差异有统计学意义(P0.05)。5、孕哺期轻度碘缺乏及补碘影响仔鼠小脑浦肯野细胞超微结构。在PN14,轻度碘缺乏组浦肯野细胞超微结构发生轻微的异常改变,表现为轻微的核膜内陷,部分线粒体嵴断裂甚至消失。补碘组浦肯野细胞超微结构基本正常,细胞核及细胞器均未发生改变。重度碘缺乏组浦肯野细胞超微结构受到严重损害。浦肯野细胞核皱缩,核膜内陷,边缘呈锯齿状;线粒体吞噬异物并且嵴断裂,光面内质网肿胀。6、孕哺期对轻度碘缺乏及补碘影响仔鼠小脑运动协调性相关蛋白表达。在PN14和PN21,轻度碘缺乏组仔鼠小脑mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表达水平均低于对照组。补碘组仔鼠小脑mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表达水平与对照组相比没有差异,但均高于轻度碘缺乏组。重度缺乏组仔鼠小脑mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表达水平均分别低于对照组和轻度碘缺乏组。结论:1、孕哺期轻度碘缺乏损伤小脑浦肯野细胞树突发育和超微结构。2、孕哺期轻度碘缺乏可能通过抑制mGluR1信号途径而损害小脑运动协调性。3、妊娠早期补碘可改善由于轻度碘缺乏所造成的小脑浦肯野细胞受损及运动协调性障碍。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R715.3
【部分图文】：

图 3.1 孕哺期轻度碘缺乏及补碘对 TH 和 TSH 水平的影响：母鼠 GD0（n = 6）；仔鼠 PN14（n = 8），PN21（n = 8）。*，与对照；#，与轻度碘缺乏组相比，P < 0.05。）哺期轻度碘缺乏及补碘影响尿碘浓度度碘缺乏组母鼠孕早期、孕中期和孕晚期 UIC 均低于对照组，差异（P < 0.05）。补碘组母鼠孕早期 UIC 低于对照组，差异有统计学，与轻度碘缺乏组相比没有统计学差异（P > 0.05）；孕中期和对照组相比均无统计学差异（P > 0.05），但均高于轻度碘缺乏组学意义（P < 0.05）。重度碘缺乏组母鼠各时期 UIC 均低于对照组组，差异有统计学意义（P < 0.05）（表 3.1）。

图 3.2 孕哺期轻度碘缺乏及补碘对仔鼠旋转杆实验的影响：n = 5-11。*，与对照组相比，P < 0.05；#，与轻度碘缺乏组相比，P < 图 3.3 孕哺期轻度碘缺乏及补碘对仔鼠平衡木实验的影响

中国医科大学硕士学位论文图 3.2 孕哺期轻度碘缺乏及补碘对仔鼠旋转杆实验的影响注：n = 5-11。*，与对照组相比，P < 0.05；#，与轻度碘缺乏组相比，P <
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本文编号：2872613