MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为19~23个核苷酸的非编码单链小RNA分子,经过加工后,通过完全配对或者不完全配对的方式结合到相对应的靶基因3’非翻译区,发挥了降解靶基因或者抑制靶基因翻译的作用,从而调控靶基因的表达,是基因表达调控研究领域的一个重大突破。miRNA作为生物体生长发育过程中的重要调控基因,目前对其研究主要方向是探查mi RNAs与各种重大疾病的发表机制、预后及治疗的关系,例如与生长发育异常的关系,与遗传或免疫疾病的关系,还有与肿瘤的关系。子宫颈癌(cervcial carcinoma,CC)是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,发病率位居女性恶性肿瘤的第二位。中国每年新发病例达13.15万,死亡人数每年约5.3万,是危害我国女性生殖健康与生命的重要疾病。宫颈癌的病理类型多种多样,鳞状细胞癌是最常见的,约占总体的85%,腺癌排第二约占10~15%,鳞腺癌3%,目前还发现一些特殊的病理类型如神经内分泌癌、小细胞癌和小圆细胞癌、透明细胞癌等,恶性程度较前3种类型高[3]。相同临床分期的宫颈癌患者的预后仍有不同差别,无淋巴结转移的早期宫颈癌患者经过规范治疗通常预后很好,五年生存率可达80~90%,而伴有淋巴结转移的相同临床分期患者五年生存率则下降至40~50%。一旦被诊断宫颈癌,对患者的家庭,社会经济和卫生资源的消耗都有较大影响。宫颈疾病的三阶梯筛查准则在宫颈癌的早发现中起了重要作用,使得宫颈癌的早期诊断率得以显著提高。但是在发展中国家,特别是落后边境地区,由于保健意识欠缺及经济条件落后,导致了诊断宫颈癌时已是晚期,失去了根治性手术治疗,或根治性放疗的时机。因此,宫颈癌的早期诊断和治疗的研究一直是我国妇科肿瘤学研究的重点。宫颈癌的治疗策略仍是以手术及放射治疗为主,对放疗不敏感、复发以及中晚期的患者,则采取辅助性治疗或姑息性的化学药物治疗或者靶向治疗。本课题组先前进行的研究,通过分析宫颈鳞癌患者的血清及组织标本的miRNA表达谱,筛选出组织及血清样本中均呈高表达的miRNA有miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p、miR-4484。miR-1246在伴有淋巴结转移的宫颈鳞癌患者的癌组织和血清中都存在趋势一致的特异性升高,通过统计分析miR-1246在血清标本中识别淋巴结转移病例的特异度为86.0%,ROC曲线下面积为84.7%。提示miR-1246可能在鳞状细胞癌这一病理类型中存在普遍的特异性高表达,可能成为类似SCC这样的血清标记物用于判断宫颈鳞癌患者的病情。并且通过生物信息学手段和生物实验证实,thrombospondin-2(THBS2)基因序列中存在mi R-1246的靶点,并证明THBS2是miR-1246的一个靶基因。THBS2是血小板反应蛋白家族中的一员,THBS2具有金属基质转移酶(MMPs)的结合位点,可协同其他基因调节细胞外基质的水解作用,调节细胞的粘附和迁移力。推测THBS2可能通过调节MMP(基质金属蛋白酶)和ECM(细胞外基质),起到抑制肿瘤血管生成的作用。本研究的主要目的是探讨慢病毒介导的miR-1246表达下调对宫颈癌细胞系SiHa增殖、凋亡和侵袭转移等生物学特性的影响以及其对下游蛋白THBS2/MMPs/ECM的影响,为以miR-1246及其靶基因为靶点的靶向治疗提供理论基础。并通过分析miR-1246的靶基因THBS2与宫颈癌临床病例病理特征和预后的关系,初步分析THBS2表达在宫颈癌中的作用,以期为宫颈癌的临床诊断、治疗和随访途径提供更多的思路。第一部分下调miR-1246表达对宫颈癌SiHa细胞增殖力,凋亡率和侵袭力的的影响1、下调体外培养的宫颈癌SiHa细胞的miR-1246表达,观察宫颈癌SiHa细胞增殖,凋亡率和侵袭力的改变目的:检测下调miR-1246表达对宫颈癌SiHa细胞侵袭力和凋亡率的能力的影响。方法:构建抑制miR-1246表达的慢病毒表达质粒及其对照质粒,包装慢病毒,感染宫颈癌SiHa细胞,使该细胞的miR-1246稳定下调表达。实验设三组:空白对照组(SiHa,Blank组)、阴性对照组(感染了携带绿色荧光表达质粒的重组慢病毒,称LV-NC)与miR-1246表达下调组(感染了携带miR-1246-Inhibitor表达质粒和绿色荧光的重组慢病毒,称为LV-miR-1246-Inh),在体外观察mi R-1246-Inh对SiHa细胞增殖及凋亡的影响。通过细胞计数绘制细胞生长曲线、CCK8法检测增殖抑制率,利用Annexin V/7-ADD双染色法及流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布情况。Transwell侵袭和迁移实验比较不同处理组细胞的侵袭力。结果:重组慢病毒LV-miR-1246-Inh可有效下调SiHa细胞内miR-1246的表达水平。细胞生长曲线和CCK8检测结果提示,LV-miR-1246-Inh组宫颈癌SiHa细胞的增殖速度低于空白对照组和阴性对照组,表明miR-1246表达下调可以抑制宫颈癌SiHa细胞的生长。流式细胞仪检测三组细胞凋亡率提示,LV-miR-1246-Inh组的宫颈癌细胞平均凋亡率高于其余两个对照组。流式细胞周期分析提示,与对照组相比,miR-1246表达下调出现细胞周期阻滞于G0/G1期,S期比率增加。这些结果表明,体外实验中,miR-1246表达下调可抑制宫颈癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,推测miR-1246在宫颈癌中发挥促进肿瘤进展的作用。结论:miR-1246表达下调可抑制人宫颈癌细胞系SiHa的增殖,阻滞细胞周期,减弱肿瘤细胞的侵袭力。2、miR-1246下调表达的体内实验研究目的:探讨miR-1246表达下调对SiHa细胞在体内肿瘤形成能力的抑制。方法:筛选稳定miR-1246表达下调的宫颈癌SiHa细胞,构建裸鼠移植瘤模型。观察抑制瘤生长曲线,计算抑瘤率。结果:LV-miR-1246-Inh组与对照组相比,成瘤时间晚,肿瘤生长缓慢,实验组肿瘤体积小于对照组,有统计学差异。结论:miR-1246表达下调可抑制移植瘤的生长。第二部分miR-1246对THBS2/MMPs信号途径的影响1、探讨miR-1246对THBS2信号途径的作用目的:研究miR-1246影响宫颈癌SiHa细胞增殖及侵袭能力的内在分子机制是否通过THBS2信号途径调节。方法:取空白对照组、阴性对照组(LV-NC)与miR-1246抑制组(LV-miR-1246-Inh)移植瘤组织,利用实时定量PCR及western blot检测THBS2及其下游基因MMP2,MMP9和ECM的mRNA及蛋白表达情况。结果:1.LV-miR-1246-Inh组中,THBS2 mRNA及蛋白表达水平最高,与对照组相比有统计学差异;2、内源性下调miR-1246水平后,THBS2相关基因MMP2、MMP9表达下降,而ECM表达上调。结论:通过分析移植瘤组织中THBS2及其相关基因的表达,提示重组慢病毒LV-miR-1246-Inh可以使得THBS2表达上调,THBS2表达上调同时其相关的基因表达同时改变。第三部分宫颈癌组织中THBS2的表达与临床病理特征和预后的关系目的:研究宫颈癌患者的组织标本中THBS2的表达与临床病理特征、预后的关系。方法:收集52例新鲜人宫颈癌组织标本,利用q RT-PCR技术检测THBS2 mRNA的相对表达量,Western Blot检测THBS2蛋白表达水平,分析THBS2表达与临床病理特征的关系。通过随访,分析THBS2表达与宫颈癌预后的关系。结果:宫颈癌组织中的THBS2表达量低于正常宫颈组织,有统计学差异(p0.05),THBS2的低表达与宫颈癌宫旁浸润、浸润深度、淋巴结转移和临床分期有关。THBS2尽管不是影响宫颈癌预后的独立因子,但是高表达者的生存期优于低表达者。结论:THBS2低表达提示宫颈癌不良预后。总结:1.用感染重组慢病毒的方法在宫颈癌细胞中稳定下调miR-1246的表达在体内外均可以抑制宫颈癌细胞SiHa生长,抑制其浸润转移。2.mi R-1246表达下调后可以负调节靶基因THBS2表达,使其表达水平上调,并且导致THBS2下游相关基因MMP2、MMP9、ECM的表达改变,从而抑制了宫颈癌SiHa细胞的增殖能力和侵袭力。3.宫颈癌组织中THBS呈低表达状态;THBS2低表达者生存期较高表达者短,提示THBS2低表达与宫颈癌恶性生长及不良预后有关,有望成为判断宫颈癌预后的标记物和基因辅助治疗的靶点。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：
毒转染人胚肾上皮细胞株 293T 和大肠杆菌 DH．5a由广西医科大学肿瘤验研究部保存；雌性 BaLb／c 裸鼠购自广西医科大学实验动物中心，4- 周龄，体重（14 士 2）g，实验计划经广西医科大学实验动物伦理委员会准。.4.2 慢病毒包装系统采用商业化的质粒载体系统，三质粒系统，由慢病毒 达 载 体 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFR-puro 以 及 pHelper1.0 载 体 和Helper2.0 载体这两种结构、包装质粒组成，表达载体采用 U6 启动子，含原核生物筛选抗性氨苄青霉素和真核生物筛选抗性（嘌呤霉素），同时含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达原件。慢病毒载体包装、感染细胞后可稳定下调表达 miR-1246（以下简称为 LV-miR-246Inh）。
图 1-2 转染前 293T 细胞密度（200 倍）Fig1-2 293T cell before infection提高转染率，转染前 2 h 最好更换为无血清培养基；混合物的预先混合，在灭菌离心管中加入重组载体质Inh，及含对照序列的质粒）20 μg、pHelper 1.0 载体质粒0 载体质粒 10 μg ，以及相应体积吉凯专用转染n2000 混合均匀，总体积约 1ml，在室温下静置孵育 15 m染混合物缓慢滴加至 293T 细胞培养液中，轻柔晃动培过程一定要轻柔且均匀，尽可能地不要将细胞吹起。放入培养 6~12 小时。养 6 h 后将含有转染混和物的无血清培养基更换为常规弃无血清培养基后 PBS 液清洗细胞表面一次，加入含
图 1-3 转染质粒后 293T GFP表达Fig1-3 GFP showed in 293T cell after transfection慢病毒毒液的收获及浓缩) 转染 24h 后收集细胞上清液至离心管，4℃、3000 转离心 10 mi胞碎片；用 0.45 μm 的无菌滤器过滤并收集滤液。培养皿内继续的含血清 DMEM 培养基，转染 72h 后可再一次收集上清液（病)将含有病毒颗粒的上清液约 40ml 转移到超速离心管，于低温超速, 4℃，25000 rpm，离心 2 h。) 离心结束后，弃去上清，适当干燥，加入病毒保存液，反复轻柔；经充分溶解后，4℃高速离心 10000 rpm、5min，收集上清按要
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本文编号：
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