HOXA10的SUMO化修饰抑制胚胎种植的机制研究

发布时间：2020-11-09 08:27

　　 目的:研究子宫内膜容受性标志分子HOXA10蛋白的SUMO化修饰抑制子宫内膜容受性和胚胎黏附的分子机制。方法:通过Western Blot和免疫组织化学染色的方法检测正常增殖期和分泌期子宫内膜以及IVF-ET后反复种植失败(Recurrent implantation failure,RIF)患者分泌中期子宫内膜中SUMO化修饰蛋白的变化。通过蛋白质免疫共沉淀结合Western Blot明确HOXA10与SUMO1分子的共价结合,并通过HOXA10质粒点突变明确其SUMO1修饰位点。体外雌孕激素联合刺激子宫上皮Ishikawa细胞后检测HOXA10的SUMO化修饰的变化。子宫内膜组织蛋白质免疫共沉淀明确RIF患者分泌中期子宫内膜中HOXA10的SUMO1修饰改变情况。免疫荧光及核质蛋白分离技术检测HOXA10WT SUMO化位点突变的HOXA10K164R的亚细胞定位。采用放线菌酮阻遏蛋白质合成的途径检测SUMO化修饰对HOXA10蛋白稳定性的影响,并通过MG132抑制泛素化降解途径明确SUMO化修饰调控HOXA10蛋白稳定性的分子机制。荧光素酶报告基因检测SUMO化修饰对HOXA10转录活性的影响,并通过DNA-蛋白质共沉淀实验明确SUMO化修饰调控HOXA10转录活性的分子机制。蛋白质免疫共沉淀结合Western Blot明确SUMO化特异性酯酶SENP1/2介导HOXA10的去SUMO1修饰。通过BeWo囊胚样细胞球与子宫内膜Ishikawa单层细胞构建的体外胚胎黏附模型检测HOXA1O的SUMO化修饰对BeWo细胞球黏附率的影响,进一步通过小鼠囊胚与Ishikawa细胞构建的体外胚胎黏附模型检测HOXA10的SUMO化修饰对小鼠囊胚黏附强度的影响。结果:第一部分结果显示分泌中期的子宫内膜组织中SUMO1修饰蛋白在分子量约 90kDa处显著降低(P0.05),而 SENP1(P0.01)、SENP2(P0.05)表达则显著升高。雌孕激素以时间依赖性的方式抑制Ishikawa细胞中分子量约90kDa的SUMO1修饰蛋白表达,SENP1、SENP2的表达则呈现时间依赖性增高。RIF患者分泌中期子宫内膜中HOXA10的蛋白表达较正常对照组没有显著变化(P=0.14),但SUMO1修饰蛋白在腺上皮和间质细胞中都明显增高(P0.01)。第二部分结果显示雌孕激素能明显抑制Ishikawa细胞中HOXA10的SUMO1修饰,且HOXA10蛋白的第164位赖氨酸残基为SUMO1分子修饰位点。HOXA10WT与SUMO化位点突变的HOXA10K164R都定位于细胞核中。SUMO化修饰通过促进HOXA10WT的泛素化修饰抑制HOXA10WT的蛋白稳定性(P0.05),通过抑制HOXA10WT与靶基因启动子区特异结合序列的结合抑制HOXA10WT的转录活性(P0.001),但不能抑制HOXA10K164R的蛋白稳定性和转录活性。SENP1、SENP2均能直接介导HOXA10的去SUMO1修饰,并促进HOXA10蛋白的稳定性(P0.05)。第三部分结果中体外胚胎粘附模型证实SUMO1修饰抑制HOXA10WT对BeWo细胞球黏附率(P0.01)及其小鼠囊胚黏附强度(P0.01)的促进作用,但不能抑制HOXA10K164R的促进作用。过表达SENP2可以逆转HOXA10的SUMO化修饰对胚胎粘附的抑制作用(P0.01)。RIF患者分泌中期子宫内膜中HOXA10的SUMO1修饰水平异常增高(P0.05)。结论:HOXA10的SUMO化修饰显著降低HOXA10蛋白的稳定性和转录活性,并抑制HOXA10介导的BeWo细胞或小鼠囊胚与子宫内膜上皮细胞间的黏附作用,而抑制HOXA10的SUMO化修饰可以改善体外胚胎的粘附。RIF患者子宫内膜中异常增高的SUMO1通过翻译后修饰调控HOXA10的蛋白功能,进而抑制子宫内膜容受性和胚胎黏附过程,是其胚胎着床失败的新分子机制。检测HOXA10蛋白的SUMO化修饰可辅助评估IVF-ET周期中子宫内膜的容受状态,有利于患者“种植窗口期”的判断,并可为提高RIF患者胚胎着床率提供研究基础、拓展治疗方向。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R714.8
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
第二章 反复种植失败患者子宫内膜中异常的SUMO化修饰蛋白表达
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
第三章 SUMO化修饰调控HOXA10的蛋白功能
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
第四章 SUMO修饰抑制HOXA10促进胚胎黏附的作用
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
总结
参考文献
第五章 综述
    前言
    子宫内膜细胞的增殖对胚胎种植的作用
    子宫内膜细胞的蜕膜化对胚胎种植的作用
    子宫内膜的容受性
    蛋白翻译后修饰在子宫内膜容受性、蜕膜化过程中的作用
    结语
    参考文献
在校期间发表文章情况及研究成果
基金资助来源
致谢
附录
    主要仪器
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本文编号：2876157