基于代谢组学技术寻找三种证型胸痹大鼠潜在生物标志物及代谢通路研究

发布时间：2020-11-10 05:38

　　 “胸痹”是以胸部闷痛、胸痛彻背、气短喘息、心悸等症为主的一种疾病。中医认为一切能引起胸部“满、闷、疼、痛”一类的疾病,都可称作胸痹。现代医学的冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病、心绞痛、心肌缺血)与其关系密切,均归于“胸痹”范畴。《中药新药临床研究指导原则2002版》将胸痹分为气滞血瘀型、气虚血瘀型、寒凝气滞型、心血瘀阻型、心肾阴虚型、痰阻心脉型、阳气虚衰型和气阴两虚型等8类主要证型。气滞血瘀、气虚血瘀与寒凝气滞型胸痹为临床主要高发证型,备受研究关注。目前大多研究是从一个或几个生化指标与不同证型的关系切入,然而由于证的整体性、动态性和异病同证、同病异证等特征,难以用单一或少数指标做完整、全面的阐释,难以体现疾病的整体性和系统性,不能反映中医证候的本质。代谢组学是系统生物学的重要组成部分,能够获得生化表达的终端信息,最具备反映和解决证型代谢物“组”、“群”、“谱”集成的分析功能。代谢组学能够对机体的整体状态进行系统分析,根据从不同个体样本获取的海量信息,构建数据模型,进行多关系、多角度度量、分类及预测。遵循整体性、动态性原则,获得较为深入的证型相关潜在生物标志物及代谢通路信息。本课题基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)分析方法对气滞血瘀型胸痹、气虚血瘀型胸痹和寒凝气滞型胸痹进行辨证分型并寻找其潜在生物标志物及相关代谢通路的研究。基于代谢组学技术对气滞血瘀型、气虚血瘀型与寒凝气滞型胸痹证的研究进展:查阅近年来国内外相关文献,梳理汇总气滞血瘀型、气虚血瘀型、寒凝气滞型的模型制备方法。采用长期束缚刺激与皮下注射肾上腺素联合、叠加皮下注射异丙肾上腺素方法制备气滞血瘀胸痹大鼠模型:采用长期强迫力竭游泳、叠加皮下注射异丙肾上腺素方法制备气虚血瘀型胸痹大鼠模型;采用冰冻、叠加皮下注射异丙肾上腺素方法制备寒凝气滞型胸痹大鼠模型。整理综述了代谢组学研究技术及代谢组学对3种证型胸痹的研究报道。代谢组学技术在新药药效研究、毒性评价和疾病诊断等诸多领域广泛开展并取得丰硕成果。它作为一种系统研究方法能在鉴别生理、病理模型上发挥重要作用。可以较为系统全面的反映生物有机体代谢产物的变化,实现通过代谢组学方法寻找胸痹不同中医证型间代谢物的异常。代谢组学技术是本课题研究的基础,通过综述其他学者运用代谢组学对3种胸痹证的研究,旨在为实验的后续工作提供系统的文献整理和参考。本文主要研究内容和结果如下:1.气滞血瘀型、气虚血瘀型、寒凝气滞型胸痹证模型建立及基础指标检测以气滞血瘀型、气虚血瘀型、寒凝气滞型胸痹大鼠为研究对象,比较不同中医证型在宏观症状、全血粘度、血脂、心肌酶、心电图、心脏组织病理切片和血液微循环等多个系统生物学指标的差异,并针对气滞血瘀型、气虚血瘀型和寒凝气滞型胸痹大鼠选择“方证相应”的冠心丹参方、通心络方与冠心苏合方给予药物治疗,比较经药物干预后血脂、心肌酶和病理切片指标的变化。具体实验方法如下,气滞血瘀型造模:大鼠给予基础饲料喂养1w环境预适应后,转为大鼠高脂饲料喂养2 w。之后放于大鼠固定器中每天束缚4 h,连续操作12 d。12 d后头部皮下注射肾上腺素0.8 mg·kg-1,每天1次,连续2d。气虚血瘀型造模:大鼠给予基础饲料喂养1w环境预适应后,转为大鼠高脂饲料喂养2w。然后每天同一时间点强迫大鼠游泳至筋疲力尽捞出(大约30min),相同操作连续进行14 d。寒凝气滞型造模:大鼠给予基础饲料喂养1w环境预适应后,转为大鼠高脂饲料喂养2 w。然后每天同一时间点放入-20℃冰柜冰冻4 h,相同操作连续进行7d。3种胸痹证型的中医证型部分造模完成后,叠加心肌缺血造模操作,期间持续喂饲高脂饲料至模型制备完成。异丙肾上腺素(ISO)以:2、4、4mg·kg-1剂量顺序连续3d皮下多点注射进行心肌缺血模型制备。继而以气滞血瘀型、气虚血瘀型、寒凝气滞型胸痹大鼠为研究对象,测定不同证型的全血粘度、血脂、心肌酶、心电图、心肌组织病理切片和血液微循环等多个系统生物学指标。心电图、心肌酶、HE染色病理切片结果表明,各组大鼠心肌缺血操作造模成功。血脂检测结果显示,3种证型大鼠血液呈现“浓、粘”状态。气滞血瘀与气虚血瘀组在高、中、低切变率的增长幅度高于寒凝气滞组切变率增长幅度,血瘀效果明显。微循环测定结果显示,寒冷刺激是微循环障碍的重要且必要造模因素。气滞血瘀型组与气虚血瘀型组模型的造模过程也呈现出一定的微循环障碍。给予相应的药物干预后,血脂、心肌酶和心脏病理切片等指标有回调趋势。从模拟病因、症状表现、实验基础指标检测、对应方药干预等方面验证三种中医胸痹证型模型建立成功。2.基于代谢组学技术寻找三种胸痹证型特征性潜在生物标志物的研究采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)分析方法,对三种中医胸痹证型大鼠血浆进行代谢组学研究。将预处理的UPLC-MS数据导入SIMCA-P软件包,进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA),以降维模式观察、识别可能的异常样品及样品之间的聚类趋势。再利用正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)鉴定各组潜在生物标志物。将筛选到的潜在生物标志物进行t检验并验证其组间差异,VIP1,P0.05认为有显著性差异。28个差异代谢物被鉴定为与气滞血瘀型胸痹相关的潜在标志物;21个差异代谢物被鉴定为与气虚血瘀型胸痹相关的潜在生物标志物;23个差异代谢物被鉴定为与寒凝气滞型胸痹相关的潜在生物标志物。3种中医证型的潜在生物标志物在维恩图中重叠,鉴别到3种中医证型的特征性潜在生物标志物。并进一步研究挖掘了与相应证型关系密切的代谢途径。三种中医证型特征性潜在生物标志物在氨基酸代谢、脂肪酸合成、脂肪酸β氧化代谢、胆汁酸代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、脂肪酸酰胺代谢和维生素B6等代谢途径发生代谢紊乱。半胱氨酸和蛋氨酸代谢、色氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是气滞血瘀型胸痹代谢紊乱的主要途径,一系列氨基酸代谢紊乱与气滞血瘀型相关性最高。花生四烯酸代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸β氧化代谢和维生素B6代谢是气虚血瘀型胸痹代谢紊乱的主要途径。赖氨酸的合成与降解、脂肪酸的代谢及甘油磷脂的代谢是寒凝气滞型代谢紊乱的主要途径。氨基酸类代谢物可为能量代谢提供底物,能量代谢紊乱,能量运行障碍有可能导致气血运行不畅,血滞成瘀,能量代谢紊乱严重影响着气滞血瘀型的发生和发展。花生四烯酸引起的炎症反应和脂肪酸酰胺引起的能量代谢紊乱和维生素B6代谢紊乱影响色氨酸的代谢间接影响能量代谢紊乱致使因气虚而无力推动血液运行障碍导致血液瘀阻症状产生。氨基酸代谢和脂肪酸代谢都严重影响能量代谢,两部分的能量代谢紊乱影响寒凝气滞型的发生发展,参与甘油磷脂代谢的溶血磷脂酰胆碱在炎症性疾病中扮演重要的角色,说明严重的能量代谢的紊乱和炎症反应与寒邪侵袭以致气血运行不畅导致寒凝气滞型的发生发展关系密切。3.基于代谢组学技术以“方证相应”反证方法验证潜在生物标志物及代谢通路研究应用代谢组学技术,采用UPLC-Q-TOF/MS方法,对气滞血瘀型、气虚血瘀型与寒凝气滞型胸痹大鼠进行“方证相应”方药干预研究。以“反证”模式验证三种中医证型胸痹动物模型,并在此基础上,深入探析三种胸痹证型的特有、共有潜在生物标志物,揭示相应代谢通路的特征性变化趋势,实现以代谢组学视角表征三种胸痹证型,发掘其内在规律。通过不同复合因素刺激大鼠,建立3种胸痹证模型。针对气滞血瘀型胸痹、气虚血瘀型胸痹和寒凝气滞型胸痹选择相应的冠心丹参方、通心络方与冠心苏合方进行药物干预治疗。运用UPLC-Q-TOF/MS对大鼠血浆样品进行分析,以降维模式观察、识别可能的异常样品及样品之间的聚类趋势,结合判别分析方法进行分类与反证动物模型。给药组与模型组相较,其代谢物轮廓向空白对照组回调,药物反证模型有效。药物干预后,能校正鉴别到的三种证型受影响的多数潜在生物标志物代谢水平,改善生物标志物参与的相应代谢通路的紊乱。气滞血瘀型大鼠氨基酸代谢紊乱得到改善,缓解了因疾病原因造成ATP合成不足而使能量代谢产生的紊乱和因能量运行障碍导致的气血运行不畅。气虚血瘀型大鼠中脂肪酸代谢紊乱得到改善,缓解能量运行障碍和因气虚无力推动血液运行障碍导致的血液瘀阻症状。寒凝气滞证大鼠中赖氨酸的降解和合成代谢得到改善,寒冷刺激使能量代谢产生紊乱,药物干预后改善了能量代谢紊乱和因能量运行障碍导致的血液凝滞症状。通过“方证相应”反证方法验证模型的成功建立,同时验证了鉴别生物标志物的可靠性。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

１．３代谢组学研究流程??代谢组学的分析技术主要包括核磁共振和质谱色谱联用两大类，其中液质联??用技术应用最为广泛，基于液质联用的典型代谢组学技术研究流程［２１］如下图１．１??所示。??代谢组学研宄??采集血浆??ＵＰＬＣ?ＩＱ－ＴＯＦ－ＭＳ??提取内源性代谢物??Ｍａｓｓ｜Ｌｙｎｘ??数据解析Ｓ１ＭＣＡ－Ｐ??１?＾??ＰＣＡ?ＰＬＳ－ＤＡ?ＯＰＬＳ－ＤＡ??、???－嘱似丨：邮賺妳热欲灿嫌？細？咖痛撕》義油＿丨》而咖和■■咖？咖??寻找潜在生物标志物??：，??代谢通路分析??Ｉ??生物学意义阐释??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｙｐｉｃａｌ?ｗｏｒｋｆｌｏｗ?ｏｆ?ＬＣ－ＭＳ?ｂａｓｅｄ?ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ??图１．１基于ＬＣ－ＭＳ的代谢组学的典型研究流程??１．４数据处理方法??１４??

中国医学科学院北京协和医学院?硕士研宄生学位论文??预适应后，转为大鼠高脂词料喂养２?ｗ，然后每天同样时间放入－２０°Ｃ冰柜冰冻４??ｈ，共冰冻７?ｄ。证型部分造模完成后，叠加心肌缺血模型造模方法，整个模型模完成，且高脂饲料持续喂养至整个模型造模完成。??

ｉ１５－?ｉｉｉｉ??＿＿＿ｇ＿??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ?ｗｉｔｈ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｓｈｅａｒ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ｗｈｏｌｅ?ｂｌｏｏｄ?ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ??图２．３各组大鼠不同切变率全血粘度??血瘀证具有浓、粘、凝、聚几个特点，血液的粘滞和流动性改变被视为中医??血瘀证诊断的微观指标［１６］。全血粘度值分析：与空白对照组相比，气滞血瘀、气??虚血瘀、寒凝气滞组血液流变学参数全血粘度高切、全血粘度中切、全血粘度低??切均有不同程度的升高。差异有统计学意义〇Ｐ＜〇．〇５），心肌缺血组也有一定的升??高。与空白对照组比较，气滞血瘀组、气虚血瘀、寒凝气滞组在２０?ｓ－１低切变率??的全血粘度增长率分别为：５８．８％
【参考文献】

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本文编号：2877550