DNA甲基化在人滋养细胞合体化中的调控作用

发布时间：2020-11-10 17:12

　　 胎盘是妊娠过程中形成的一个独特且高度动态变化的临时器官,对孕产妇及胎儿的健康至关重要。DNA甲基化作为经典的表观遗传学调控方式,其在胎盘发育及滋养细胞合体化中的作用,以及这种调控异常是否参与子痫前期的发生,目前均不清楚。本研究综合利用人原代滋养细胞(Human primary trophoblast,PHT)、细胞系及临床样本,采用免疫组织化学、Western Blot、免疫荧光、生物信息学分析等技术,明确5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)1、3A、3B在人正常胎盘及子痫前期胎盘滋养细胞中的表达模式;阐明DNMT1、3A、3B在滋养细胞合体化过程中的作用;筛选合体化前后潜在受甲基化调控的差异表达基因;最后探明DNMTs与CREB信号通路的相互关系。获得的研究结果如下:一、滋养细胞中DNMTs的表达模式和甲基化水平利用人早孕绒毛组织、人绒毛合体滋养层重建模型、原代滋养细胞体外自发合体化模型及BeWo细胞系体外诱导合体化模型,通过免疫组织化学、免疫荧光、Western Blot等技术,研究DNMTs在滋养细胞中的表达模式,结果显示:DNMTs及5mC在早孕绒毛组织中均高表达于细胞滋养细胞层,少量表达于合体滋养细胞层,在新发合体滋养细胞层亦表达较低;在原代滋养细胞体外自发合体化及BeWo细胞系诱导合体化过程中均伴随DNMTs的降低表达。二、DNMTs在滋养细胞合体化过程中的作用采用细胞免疫荧光、Western Blot等技术,探究DNMTs差异表达对BeWo细胞系合体化的影响,结果显示:DNA甲基转移酶抑制剂5-aza抑制DNMTs的表达,BeWo细胞合体化增强;过表达DNMTs后BeWo细胞合体化受到阻碍。在原代滋养细胞体外自发合体化过程中利用cAMP/PKA/CREB信号通路抑制剂H89处理及BeWo细胞系5-aza诱导去甲基化模型中探究DNMTs与CREB信号通路的相互关系。Western Blot结果显示H89能够显著抑制原代滋养细胞体外自发合体化过程中CREB磷酸化及合体化标志物蛋白水平的表达,但因自发合体化引起的DNMTs的下调未能恢复;5-aza可诱导BeWo细胞系中DNMTs蛋白表达降低、磷酸化CREB蛋白表达升高。三、筛选合体化前后潜在受甲基化调控的差异表达基因基于原代滋养细胞体外自发合体化前后的甲基化芯片测序数据及GEO网上数据库,运用GO和KEGG聚类方法筛选出合体化前后去甲基化并且上调表达的差异基因,并利用荧光定量PCR、Western Blot、免疫组织化学等技术对差异基因验证。筛选出59个在合体化过程中去甲基化并且上调表达的目标基因,并进一步在BeWo细胞去甲基化模型中证实甲基化水平升高、转录组表达降低的调控模式,初步筛选出合体化过程中受甲基化调控的靶标因子Wnt7a。四、PE胎盘滋养细胞中DNMTs的表达模式和甲基化水平利用对照个体及PE足月胎盘组织以及分离的原代滋养细胞体外自发合体化模型,采用免疫组织化学、免疫荧光、Western Blot等技术,研究DNMTs在PE滋养细胞中的表达,结果显示:PE胎盘组织中合体滋养细胞减少,DNMTs及5mC表达水平均高于正常胎盘组织;PE胎盘原代滋养细胞体外自发合体化能力降低。综合以上结果,我们认为,在滋养细胞合体化过程中DNMTs下调表达,甲基化水平降低;DNA甲基化可能通过调控CREB信号通路磷酸化激活参与调控合体化过程;Wnt7a是在合体化过程中受甲基化调控的靶标因子;DNMTs异常表达影响PE胎盘中滋养细胞的合体化进程,可能与PE发生相关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R714
【部分图文】：

组之间的差异，且 P 值<0.05 具有统计学差异。每个实验至少包括三组样品重复。2 结果2.1 早孕绒毛组织中 DNA 甲基转移酶（DNMTs）的表达模式和甲基化水平免疫组织化学结果显示（图 1A），在 6-8 周的早孕胎盘绒毛组织中，CK7 标记绒毛组织的细胞滋养细胞（CTB），CTB 的外侧为合体滋养细胞（STB），通过连续切片可以看出，DNMT1、3A、3B 和 5mC 在 CTB 层的表达都明显高于 STB层，提示 CTB 中的甲基化水平高于 STB。合体滋养层重建结果显示（图 1B），新发 STB 层 DNMT1、3A、3B 和 5mC 的表达在 STB 层均显著低于 CTB 层，提示 CTB 向 STB 分化过程中 DNMTs 下调表达，甲基化水平可能降低。

细胞核聚集、合胞体增多，融合效率达 67%（图 2B），且 DNMT1、3A、3B 和 5mC 均下调表达（图2C）。Westernblot 印迹分析结果显示，48h 后合体化标志物 Syncytin-1、GCM1、β-HCG 蛋白水平升高，DNMTs 蛋白表达降低，表明在 48h 体外自发合体化后伴随 DNMTs 表达降低（图 2D）。接着在 BeWo 细胞系中建立合体化模型，利用cAMP 信号通路激活剂 FSK 以及 8-Br-cAMP 诱导细胞合体化[5,18]，72h 后，免疫荧光标记 E-cadherin，在诱导组均表达降低且出现细胞核聚集成簇现象（图 2E）

图 3 DNMTs 差异表达对 BeWo 细胞合体化的影响Figure 3 The Effect of differential expressed DNMTs on the fusion of BeWo cellsA. Immunofluorescence detecting cell fusion after 5-aza treatment; B. Immunofluorescencedetection of co-localization of E-cad with 5mC, DNMT1, 3Aand 3B following 5-azatreatment in BeWo cells; C. Western blot analysis of DNMTs and syncytiotrophoblastmakers proteins expression under 5-aza treatment in BeWo cells; D. Western blot analysis ofDNMTs and syncytiotrophoblast makers expression after overexpression of DNMT1, 3A, 3Bcombined with fusion induction in BeWo cells; E. Immunofluorescence detection of cellfusion under forced expression of DNMT1, 3A, 3B combined with Forskolin treatment. Scalebar 50μm; F. qRT-PCR detection mRNAlevel of DNMTs and syncytiotrophoblast makers inForskolin treatment BeWo cells with forced expression of DNMT1, 3A, 3B.2.4 DNMTs 参与调控 CREB 信号通路
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本文编号：2878156