miR-99b-5p靶向mTOR诱导子宫内膜癌细胞自噬

发布时间：2017-04-12 04:06

  本文关键词：miR-99b-5p靶向mTOR诱导子宫内膜癌细胞自噬，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:EEC进程中自噬逐渐减弱,其机制和病理生理意义均不清楚,而自噬是第二大程序化细胞死亡方式,m TOR是自噬的核心调控器,m TOR在EEC进程中活性增强。has-mi R-99b-5p是已经被生物信息学和实验证实的强靶向m TOR的mi Rs,其在子宫内膜癌的进程中表达水平与子宫内膜癌自噬情况同步,也是逐渐减弱,故该mi R存在通过m TOR调控EEC自噬的可能,并诱导EEC自噬性死亡。本研究主要目的是证实mi R-99b-5p可以靶向作用于m TOR诱导ishikawa细胞自噬,分析其调控自噬的时间和剂量效应,为后续研究促使子宫内膜癌细胞自噬性死亡的机制和调控自噬为子宫内膜癌治疗提供新的理论依据。方法:首先进行mi R99b-5p与m TOR靶向结合的生物信息学分析,进行子宫内膜癌细胞的培养,然后分析mi R99b-5p在不同浓度和不同时间下诱导子宫内膜癌细胞自噬相关蛋白的m RNA及其蛋白水平变化的情况。设置相同浓度mi R99b-5p进行不同时间的转染并观察作用于子宫内膜癌细胞,再次行蛋白印迹法检测自噬标志蛋白LC3和beclin1的表达情况,RT-PCR检测自噬基因beclin1的m RNA的表达水平。第三,设置对照组观察添加特异性自噬诱导剂雷帕霉素、自噬特异性抑制剂3MA和CQ与mi R99b-5p共同孵育后,观察细胞形态学LC3细胞免疫荧光和MDC自噬泡染色方法检测自噬标志物的表达情况,系统地分析mi R99b-5p诱导子宫内膜癌细胞自噬的发生。Western blot检测信号通路关键蛋白m TOR,LC3表达。细胞免疫荧光检测自噬蛋白MAP1-LC3表达量,MDC染色法检测自噬泡的数量。用SPSS 13.0软件进行实验数据分析并作图。结果:生物信息学分析结果表明,mi R-99b-5p以m TOR为靶基因,且具有保守性。mi R-99b-5p剂量和时间依赖性地诱导ishikawa细胞自噬,以80nm和作用时间为6h时,mi R-99b-5p对ishikawa细胞自噬的诱导作用最为明显,其增加LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比率,促进beclin-1蛋白和m RNA的表达,细胞内的自噬泡和自噬小体数量均明显增加了,分别用3MA和CQ抑制自噬过程后,则mi R-99b-5p对ishikawa细胞自噬的诱导作用均减弱。结论:mi R-99b-5p靶向结合自噬调控关键蛋白m TOR;mi R99b-5p在浓度和时间依赖性上调LC3和beclin1表达;抑制自噬减低mi R-99b-5p对ishikawa细胞凋亡的诱导作用。
【关键词】：自噬 凋亡 ishikawa细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 缩略语10-11
• 前言11-16
• 1 材料与方法16-22
• 1.1 实验材料16-17
• 1.2 实验方法17-22
• 2 结果22-34
• 2.1 miR-99b-5p对mTOR靶基因生物信息学分析22-26
• 2.2 miR-199a-3p浓度和时间依赖性上调LC3和beclin1表达26-31
• 2.3 抑制自噬过程减低miR-99b-5p对ishikawa细胞自噬的诱导作用31-34
• 3 讨论34-38
• 4 结论38-39
• 参考文献39-43
• 文献综述43-51
• 参考文献48-51
• 攻读学位期间发表的论文51-52
• 致谢52

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本文编号：300661