五味子脂A通过抑制ROS增强紫杉醇抑制卵巢癌Skov3细胞增殖的作用及机制

发布时间：2017-04-22 22:02

  本文关键词：五味子脂A通过抑制ROS增强紫杉醇抑制卵巢癌Skov3细胞增殖的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验背景：卵巢癌的病死率居于妇科恶性肿瘤的首位。因早期症状不典型，故在发现时已处于晚期，导致预后较差，病死率较高。目前卵巢癌的治疗方式主要是肿瘤细胞减灭术，并在术后给予辅助化疗（紫杉醇+卡铂方案为主）。但是在临床应用中，化疗常常引起不良反应及耐药性，因此，如何减轻药物的不良反应、降低耐药性的发生、增强药物的抗肿瘤作用，成为研究的焦点。 五味子（Fructus Schizandra，FS）是常用中药，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，药用价值较高。既往研究发现，五味子粗提物及其活性成分可通过抑制P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和蛋白激酶C（protein kinase C，，PKC）的表达，从而逆转肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）[1]。 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是化学性质活跃的含氧原子或原子团，具有较强的氧化能力[2]，在先天免疫调节中发挥着重要作用，但是过量的ROS可介导氧化应激反应，导致不可逆转的细胞损伤，并最终导致细胞死亡[3]。研究表明[4]，大量的ROS通过介导线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）突变和更多ROS的蓄积，从而产生持续的氧化应激状态，从而有利于癌症的发生。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）为巯基类化合物，是一种抗氧化剂，可作为ROS抑制剂，容易通过细胞膜，影响细胞内的氧化还原状态，并有效地减少氧化损伤的发生[5]。 实验目的：观察五味子脂A（GomisinA，GA）与紫杉醇联合应用后，卵巢癌Skov3细胞中ROS的变化，探讨ROS在GA增强紫杉醇化疗敏感性中的作用机制。 实验方法：体外培养人浆液性囊腺性卵巢癌细胞Skov3，分组给予GA和/或紫杉醇，或者给予NAC和/或紫杉醇，分别作用6小时，应用MTT法检测各组细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期及ROS水平，Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA）染色检测ROS水平，Western blot检测细胞周期相关蛋白CDK4、CyclinB1、P53的表达。 实验结果：五味子脂A与紫杉醇联合作用于卵巢癌Skov3细胞，可增强紫杉醇的化疗敏感性，协同抑制Skov3细胞的增殖。通过流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及ROS，发现五味子脂A可通过降低ROS水平抑制细胞周期，从而发挥协同紫杉醇的抗肿瘤作用；通过Western blot检测发现，五味子脂A与紫杉醇单独给药后，可影响细胞周期相关蛋白CDK4、CyclinB1和P53的表达，联合用药组后蛋白表达的改变更加明显。从NAC作用后，可得出与五味子脂A相同的结果，进一步证实五味子脂A通过降低ROS水平，增强紫杉醇对卵巢癌细胞Skov3增殖的敏感性。 结论：五味子脂A与紫杉醇联合应用于卵巢癌Skov3细胞，可通过抑制细胞周期，增强紫杉醇的敏感性，提高药物的抗肿瘤效果。这一作用的机制可能是五味子脂A下降Skov3细胞中的ROS水平，通过调节细胞周期蛋白CDK4、CyclinB1及P53的表达，来抑制细胞周期进程。
【关键词】：Skov3细胞 紫杉醇 五味子脂A 活性氧 细胞周期
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要英文词缩写表10-11
• 第1章 引言11-12
• 第2章 文献综述12-16
• 2.1 肿瘤细胞的多药耐药性12
• 2.2 中药协同化疗药物抗肿瘤作用的机制12-16
• 2.2.1 诱导细胞凋亡13
• 2.2.2 抑制细胞周期13
• 2.2.3 逆转肿瘤细胞中多药耐药基因 P-gp 的表达13-14
• 2.2.4 拮抗钙离子通道，增加细胞内药物浓度14
• 2.2.5 抑制 ABCB1 的药物转运功能，减少药物排出14
• 2.2.6 降低谷胱甘肽 S-转移酶活性，减少细胞内药物代谢14-15
• 2.2.7 抑制 DNA 损伤修复相关蛋白的表达15
• 2.2.8 增加细胞内活性氧的产生15-16
• 第3章 研究内容16-25
• 3.1 材料16-19
• 3.1.1 实验用细胞株16
• 3.1.2 主要实验仪器16-17
• 3.1.3 实验试剂17-18
• 3.1.3.1 实验用药物17
• 3.1.3.2 细胞培养相关试剂17
• 3.1.3.3 Annexin V-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒17
• 3.1.3.4 Western-blot相关试剂17-18
• 3.1.3.5 其他相关试剂18
• 3.1.4 主要试剂的配制方法18-19
• 3.2 实验方法19-24
• 3.2.1 细胞培养19-20
• 3.2.1.1 细胞复苏及换液19
• 3.2.1.2 细胞换液19
• 3.2.1.3 细胞传代19
• 3.2.1.4 细胞冻存19-20
• 3.2.2 MTT法检测Skov3细胞的增殖活性20
• 3.2.3 DHE染色检测活性氧20-21
• 3.2.4 流式细胞术检测活性氧21
• 3.2.5 Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡21
• 3.2.6 PI单染检测细胞周期21-22
• 3.2.7 Western blot检测β-actin、CDK4、P53、CyclinB1蛋白的表达22-24
• 3.2.7.1 提取样本总蛋白22
• 3.2.7.2 蛋白定量22
• 3.2.7.3 配置聚丙烯酰胺凝胶22-23
• 3.2.7.4 SDS-PAGE 电泳23
• 3.2.7.5 免疫印迹杂交23
• 3.2.7.6 脱脂牛奶封闭23
• 3.2.7.7 抗体孵育23-24
• 3.2.7.8 显色24
• 3.3 统计学分析24-25
• 第4章 实验结果25-37
• 4.1 五味子脂A增强紫杉醇抑瘤作用25-31
• 4.1.1 MTT 法检测联合用药对 Skov3 细胞增殖的抑制作用25
• 4.1.2 五味子脂A下调紫杉醇处理后Skov3细胞中的ROS25-27
• 4.1.2.1 DHE染色检测活性氧25-26
• 4.1.2.2 流式细胞术检测GA联合PTX作用于Skov3后细胞内活性氧26-27
• 4.1.3 流式细胞术检测联合用药后 Skov3 细胞的凋亡百分率27-28
• 4.1.4 流式细胞术检测 GA 与 PTX 联合用药后对 Skov3 细胞周期的影响28-29
• 4.1.5 Western Blot 方法检测联合用药后 Skov3 细胞中周期相关蛋白的表达29-31
• 4.2 抗氧化剂NAC增强紫杉醇抑瘤作用的研究31-37
• 4.2.1 MTT 法检测 NAC 联合 PTX 作用于 Skov3 后对细胞增殖的抑制作用31
• 4.2.2 NAC 下调紫杉醇处理后 Skov3 细胞中的 ROS31-33
• 4.2.2.1 DHE 染色检测活性氧31-32
• 4.2.2.2 流式细胞术检测活性氧32-33
• 4.2.3 流式细胞术检测 NAC 与 PTX 联合用药后 Skov3 细胞的凋亡百分率33-34
• 4.2.4 流式细胞术检测 NAC 与 PTX 联合用药对 Skov3 细胞周期的影响34-35
• 4.2.5 Western Blot 方法检测联合用药后 Skov3 细胞中周期相关蛋白的表达35-37
• 第5章 讨论37-42
• 5.1 五味子脂A联合紫杉醇抑制Skov3细胞的增殖37-38
• 5.2 五味子脂 A 联合紫杉醇诱导卵巢癌 Skov3 细胞内活性氧的改变38-39
• 5.3 五味子脂 A 与紫杉醇联合应用对卵巢癌 Skov3 细胞凋亡的影响39
• 5.4 五味子脂 A 与紫杉醇联合应用后对卵巢癌 Skov3 细胞周期的影响39-40
• 5.5 五味子脂 A 与紫杉醇联合应用后对卵巢癌 Skov3 细胞周期影响的分子机制40-42
• 第6章 结论42-43
• 参考文献43-47
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果47-48
• 致谢48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：321334