CRISPR/Cas系统干扰HPV16 E6基因对SiHa细胞增殖和凋亡影响
发布时间：2021-07-04 01:01
目的研究人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型的E6病毒癌基因被特异性靶向HPV16-E6位点成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）定点敲除后,宫颈癌细胞系SiHa在细胞凋亡和增殖方面的变化。方法设计靶向HPV16E6基因的向导RNA（guide RNA,gRNA）,脂质体介导gRNA质粒和Cas9质粒对HPV16阳性人宫颈癌细胞系SiHa和HPV16阴性的正常人胚肾上皮HEK293细胞转染。流式细胞术检测SiHa和HEK293细胞转染前后细胞在凋亡率方面的变化;CCK8法检测转染前后两种细胞的增殖能力变化;蛋白质印迹法检测E6基因敲除后,SiHa细胞中E6蛋白和p53蛋白的表达水平。结果将靶向HPV16E6基因的gRNA质粒和Cas9质粒共同转染SiHa细胞48h后,E6-gRNA/Cas9组SiHa细胞凋亡率为25.6%,与未转染gRNA和Cas9质粒的SiHa细胞空白组（2%）以及只转染等量Cas9质粒的Cas9组（3%）相...
【文章来源】：中华肿瘤防治杂志. 2015,22(18)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图１靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ作用模式
ｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）底物显色，采集图像，对目的蛋白进行定量分析。１．４统计学方法Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ软件绘制图表。数据以ｘ－±ｓ表示。采用ＳＰＳＳ１５．０进行统计学分析，各组数据经过正态性检验和方差齐性检验分析后，总体服从正态分布，且总体方差齐。多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ法。检验水准α＝０．０５。２结果２．１ＣＲＩＳＰＲ对Ｅ６基因的作用作用于ＨＰＶ１６Ｅ６基因特定位点的ＣＲＩＳＰＲ造成Ｅ６基因相应位点ＤＮＡ双链断裂的情况见图２。由于靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ能够介导识别特定位点双链ＤＮＡ断裂，而机体细胞在修复双链切口的过程中产生随机突变，Ｔ７Ｅ１酶可以识别突变位点，因此通过Ｔ７Ｅ１酶切鉴定ＣＲＩＳＰＲ在Ｅ６基因位点上产生ＤＳＢ的效率。图２示，将Ｔ７Ｅ１酶切回收后的ＰＣＲ产物进行１０％ＴＢＥ凝胶电泳，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组显示３条带：５００ｂｐ的ＰＣＲ产物条带、２００和３００ｂｐ处的酶切产物条带，而Ｃａｓ９组和空白组只显示５００ｂｐ处的ＰＣＲ产物条带，表明Ｔ７核酸酶特异识别ＤＮＡ错配位点并产生了切割。注：Ｍ．５００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．空白组；２．Ｃａｓ９组；３．Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组图２Ｔ７Ｅ１酶切分析ＳｉＨａ细胞ＨＰＶ１６Ｅ６基因双链ＤＮＡ断裂情况２．２ＣＲＩＳＰＲ对ＳｉＨａ细胞凋亡的影响靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ可以促进ＳｉＨａ细胞凋亡。转染４８ｈ后，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组凋亡率达到２５．６％，Ｃａｓ９组和空白组ＳｉＨａ细胞凋亡率分别为３％和２％。转染４８ｈ后，与Ｃａｓ９组和空白组
白组相比较，差异无统计学意义，Ｐ＝０．４２２。而ＨＥＫ２９３细胞的Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组、Ｃａｓ９组和空白组在４９０ｎｍ处的细胞增殖抑制率无明显变化，细胞增殖活性差异无统计学意义，Ｆ＝０．２１９，Ｐ＝０．８１０。实验结果进一步证实了靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ只对ＨＰＶ１６阳性的ＳｉＨａ细胞起作用，能够抑制ＨＰＶ１６阳性ＳｉＨａ细胞增殖，而对ＨＰＶ１６阴性的ＨＥＫ２９３细胞没有增殖抑制作用。注：Ａ．ＣＲＩＳＰＲ转染ＳｉＨａ细胞；Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ转染ＨＥＫ２９３细胞图３流式细胞仪分析转染靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ后ＳｉＨａ细胞和ＨＥＫ２９３细胞凋亡的情况２．４转染ＣＲＩＳＰＲ对ＳｉＨａ细胞Ｅ６和ｐ５３蛋白表达影响转染４８ｈ后，蛋白质印迹法检测Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组、Ｃａｓ９组和空白组Ｅ６与ｐ５３蛋白表达情况。研究发现，各组内参蛋白β－ａｃｔｉｎ的条带亮度接近，而Ｅ６和ｐ５３条带亮度差异明显。空白组、Ｃａｓ９组和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组Ｅ６蛋白表达相对含量分别为（９５．４４±０．７９）％、（８８．５５±０．７１）％和（５０．２０±０．６２）％。Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组与空白组和Ｃａｓ９组相比，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组Ｅ６蛋白表达明显降低，Ｅ６蛋白抑制率为－４５．２４％，Ｆ＝３０．３９２，Ｐ＜０．００１（图５）。空白组、Ｃａｓ９组和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组ｐ５３蛋白表达相对含量分别为（１００．２８±０．７３）％、（１５０．６６±０．８０）％和（３５０．３６±０．７７）％。与空白组相比，ｐ５３蛋白表达增加＋２
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因[J]. 马元武,马婧,路迎冬,陈炜,张旭,于磊,张连峰. 中国比较医学杂志. 2014(03)
[2]HPV16E7 siRNA表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的研究[J]. 王丹青,彭芝兰,周慧梅,李大可. 中华肿瘤防治杂志. 2007(13)
本文编号：3263707
【文章来源】：中华肿瘤防治杂志. 2015,22(18)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图１靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ作用模式
ｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）底物显色，采集图像，对目的蛋白进行定量分析。１．４统计学方法Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ软件绘制图表。数据以ｘ－±ｓ表示。采用ＳＰＳＳ１５．０进行统计学分析，各组数据经过正态性检验和方差齐性检验分析后，总体服从正态分布，且总体方差齐。多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用ＬＳＤ法。检验水准α＝０．０５。２结果２．１ＣＲＩＳＰＲ对Ｅ６基因的作用作用于ＨＰＶ１６Ｅ６基因特定位点的ＣＲＩＳＰＲ造成Ｅ６基因相应位点ＤＮＡ双链断裂的情况见图２。由于靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ能够介导识别特定位点双链ＤＮＡ断裂，而机体细胞在修复双链切口的过程中产生随机突变，Ｔ７Ｅ１酶可以识别突变位点，因此通过Ｔ７Ｅ１酶切鉴定ＣＲＩＳＰＲ在Ｅ６基因位点上产生ＤＳＢ的效率。图２示，将Ｔ７Ｅ１酶切回收后的ＰＣＲ产物进行１０％ＴＢＥ凝胶电泳，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组显示３条带：５００ｂｐ的ＰＣＲ产物条带、２００和３００ｂｐ处的酶切产物条带，而Ｃａｓ９组和空白组只显示５００ｂｐ处的ＰＣＲ产物条带，表明Ｔ７核酸酶特异识别ＤＮＡ错配位点并产生了切割。注：Ｍ．５００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．空白组；２．Ｃａｓ９组；３．Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组图２Ｔ７Ｅ１酶切分析ＳｉＨａ细胞ＨＰＶ１６Ｅ６基因双链ＤＮＡ断裂情况２．２ＣＲＩＳＰＲ对ＳｉＨａ细胞凋亡的影响靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ可以促进ＳｉＨａ细胞凋亡。转染４８ｈ后，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组凋亡率达到２５．６％，Ｃａｓ９组和空白组ＳｉＨａ细胞凋亡率分别为３％和２％。转染４８ｈ后，与Ｃａｓ９组和空白组
白组相比较，差异无统计学意义，Ｐ＝０．４２２。而ＨＥＫ２９３细胞的Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组、Ｃａｓ９组和空白组在４９０ｎｍ处的细胞增殖抑制率无明显变化，细胞增殖活性差异无统计学意义，Ｆ＝０．２１９，Ｐ＝０．８１０。实验结果进一步证实了靶向ＨＰＶ１６Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ只对ＨＰＶ１６阳性的ＳｉＨａ细胞起作用，能够抑制ＨＰＶ１６阳性ＳｉＨａ细胞增殖，而对ＨＰＶ１６阴性的ＨＥＫ２９３细胞没有增殖抑制作用。注：Ａ．ＣＲＩＳＰＲ转染ＳｉＨａ细胞；Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ转染ＨＥＫ２９３细胞图３流式细胞仪分析转染靶向ＨＰＶ１６－Ｅ６基因的ＣＲＩＳＰＲ后ＳｉＨａ细胞和ＨＥＫ２９３细胞凋亡的情况２．４转染ＣＲＩＳＰＲ对ＳｉＨａ细胞Ｅ６和ｐ５３蛋白表达影响转染４８ｈ后，蛋白质印迹法检测Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组、Ｃａｓ９组和空白组Ｅ６与ｐ５３蛋白表达情况。研究发现，各组内参蛋白β－ａｃｔｉｎ的条带亮度接近，而Ｅ６和ｐ５３条带亮度差异明显。空白组、Ｃａｓ９组和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组Ｅ６蛋白表达相对含量分别为（９５．４４±０．７９）％、（８８．５５±０．７１）％和（５０．２０±０．６２）％。Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组与空白组和Ｃａｓ９组相比，Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组Ｅ６蛋白表达明显降低，Ｅ６蛋白抑制率为－４５．２４％，Ｆ＝３０．３９２，Ｐ＜０．００１（图５）。空白组、Ｃａｓ９组和Ｅ６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９组ｐ５３蛋白表达相对含量分别为（１００．２８±０．７３）％、（１５０．６６±０．８０）％和（３５０．３６±０．７７）％。与空白组相比，ｐ５３蛋白表达增加＋２
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因[J]. 马元武,马婧,路迎冬,陈炜,张旭,于磊,张连峰. 中国比较医学杂志. 2014(03)
[2]HPV16E7 siRNA表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的研究[J]. 王丹青,彭芝兰,周慧梅,李大可. 中华肿瘤防治杂志. 2007(13)
本文编号：3263707
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