过表达LCN-2卵巢癌细胞系的构建及影响

发布时间：2017-04-27 13:01

  本文关键词：过表达LCN-2卵巢癌细胞系的构建及影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：卵巢癌在妇科的恶性肿瘤中病死率极高,是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重威胁着女性健康。虽然诊断方法仍在不断的改进,但是卵巢癌的易复发及伴随出现的转移和多重耐药性,严重影响到卵巢癌的冶疗效果。由于在患病早期无特异性症状,缺乏有效的早期诊断措施,大部分患者确诊时已多处于晚期,让患者错过了最佳的治疗时机。为了能够做到早诊断早治疗,在早期有一些肿瘤抗原标记物,例如经典的CA125、CA199等,对于不同类型、不同部位的肿瘤大多伴有不同程度的变化。特别是一些肿瘤标记物随着恶性程度的增加有相应规律的变化,虽不具有普遍性,但已经对卵巢癌的早期诊断、治疗及手术预后疗效的改善给予了极大的参考意见。脂质运载蛋白-2(lipocalin-2, LCN-2),是分泌型糖蛋白,又命名为中性粒细胞明胶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin, NGAL),属于脂质运载蛋白家族的第2号成员。研究发现,LCN-2的上凋与多种人类肿瘤相关,包括肝癌,乳腺癌,子宫内膜癌和卵巢癌。然而,LCN-2在肿瘤细胞中的生物学作用还不是很清楚。本研究通过过表达LC-2的方法来检测其对卵巢癌细胞增殖的影响,探讨LCN-2在卵巢癌中的表达和发展规律,为进一步研究LCN-2在卵巢癌细胞中的作用机制提供信息平台,以及为治疗卵巢癌提供更多有价值的信息。方法：Western Blot分析检测四种细胞系中(CAOV3, ES2, OVCAR3, SKOV3)LCN-2蛋白水平上的表达；瞬时转染LCN-2质粒后通过WesternBlot分析检测过表达LCN-2在卵巢癌细胞ES2中的蛋白表达；进行G418筛选,探测未转染质粒的ES2细胞的生存临界浓度；采用稳定转染法观察过表达LCN-2在卵巢癌细胞中的生长状况,通过G418的筛选建立稳定过表达LCN-2的ES2细胞系；MTT细胞增殖试验检测过表达LCN-2对卵巢癌细胞增殖的影响。结果：KOV3) LCN-2表达情况,CAOV3(?)OVCAR3王高表达,ES2未表达,SKOV3较低表达Western B lot检测这四种卵巢癌细胞系LCN-2表达情况,CAOV3和OVCAR3明显表达,ES2未表达,SKOV3无明显表达。常规细胞培养后,镜下观察四种细胞系的生长状态,CAOV3和OVCAR3细胞形态大多为菱形和多边形上皮样细胞状,ES2细胞形态呈椭圆形,SKOV3呈梭状上皮样细胞形态。2构建pcDNA3.1/mycHis-LCN-2质粒DNA后,采用瞬时转染法,验证质粒及LCN-2抗体的可用性首先我们用实验室已有的空载体pcDNA3.1/mycHis-LACZ 和PEGFP-N3,分别构建了pcDNA3.1/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2重组质粒DNA。因LCN-2在ES2细胞中不表达,所以选择ES2做瞬时转染,pcDNA3.1/mycHis-LCN-2, PEGFPN3-LCN-2作为实验组；pcDNA3.1/mycHi-s-LACZ, PEGFPN3作为对照组,24小时后全部收获,Western Blot分析检测转染LCN-2的实验组均明显过表达,充分可以说明LCN-2质粒构建成功,抗体结合良好。3 G418药物浓度检测ES2产生耐药的生长临界浓度是700μg/m1。G418药物浓度梯度(200μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,900μg/ml, 1200μg/ml,1500μg/ml)置于六孔板中,观察7天后发现ES2产生耐药的生长临界浓度为700μg/ml。4成功构建LCN-2稳定过表达的ES2细胞系瞬时转染的预实验成功后,稳定转染ES2细胞系,用700μg/ml G418进行筛选,约两周后克隆形成。选择生长状态良好的细胞团进行增殖,收获后Western Blot分析检测发现LCN-2在#2,#3,#12,#14,#21,#22,#23和#31细胞株中的表达相对于V1,V2,V3和V7中明显升高。Western Blot再次分析验证了LCN-2在#2,#3,#31和#23中的稳定过表达,并镜下观察发现ES2细胞株和稳定转染LCN2后的ES2形态无明显变化。5 MTT细胞增殖试验发现LCN-2有促进卵巢癌细胞增殖的作用我们选取稳定过表达LCN-2的#2和#3的两个细胞株作为实验组；空载体V1和V2的细胞株作为对照组,经过6天的连续检测,LCN-2过表达组,相对于对照组,细胞的增殖速度明显加快,差异具有统计学意义(P0.05)。结论：1成功构建了pcDNA/mycHis-LCN-2和PEGFPN3-LCN-2表达载体。2 LCN-2在卵巢癌细胞系中的表达差异,对于研究LCN-2在卵巢癌中的作用具有重要的价值。3 LCN-2的抗体与抗原结合良好,抗体效价较高。4构建的LCN-2稳定过表达的细胞系为以后进一步研究LCN-2在卵巢癌中的生物学作用打下基础。5过表达LCN-2对卵巢癌细胞的增殖有促进作用。
【关键词】：LCN-2 卵巢癌细胞 细胞增殖 ES-2细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-11
• 材料与方法11-21
• 结果21-25
• 附图25-29
• 附表29-30
• 讨论30-31
• 结论31
• 参考文献31-33
• 综述 LCN-2 在人类肿瘤中的研究进展33-40
• 参考文献36-40
• 致谢40-41
• 个人简历41

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 方峻,魏文宁,刘仲萍,宋善俊;人组织因子基因表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达[J];中国实验血液学杂志;2003年06期

2 吴尚辉,邓朝晖,祝斌,顾焕华,罗学滨,祝和成;一株新的卵巢癌细胞系的建立及其生物学特性分析[J];实用预防医学;2005年01期

3 李晓艳;王泽华;;卵巢癌细胞系中环氧化酶2的表达研究[J];邯郸医学高等专科学校学报;2006年02期

4 程继文;蔡捷;邝晓聪;陈心秋;唐步坚;黄清华;刘燕;李力;;腹水来源卵巢癌细胞系的建立及其生物学特性[J];癌症;2009年03期

5 徐红梅;夏美慧;梁作文;钟加滕;赵雪俭;何津;;卵巢癌细胞系中差异表达蛋白的相关性研究[J];中国妇幼保健;2010年07期

6 卢建,张金山,牟瀚舟,许沈华;糖皮质激素对人卵巢癌细胞系增殖的抑制作用[J];中华妇产科杂志;1996年03期

7 徐明娟,刘宇健,宋亮年,王昭梅,张琼;视黄酸对人卵巢癌细胞系3AO增殖分化的影响[J];第二军医大学学报;1997年05期

8 顾琳慧;郑智国;陈鲁;许沈华;;高低转移人乳头状浆液性卵巢癌细胞系蛋白表达差异及其意义[J];中国实用妇科与产科杂志;2009年11期

9 王晶;雷利娜;尹洪丽;;透明质酸结合蛋白1在人卵巢癌细胞系中表达及其与紫杉醇敏感性的关系[J];中国实用妇科与产科杂志;2012年01期

10 王建六，钱和年，，李文锦，冯捷;人卵巢癌细胞系在不同品系免疫小鼠肾包膜下生长规律的探讨[J];现代妇产科进展;1995年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 郑智国;高

本文编号：330633