RNA干扰沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌SiHa细胞自噬的影响

发布时间：2017-05-29 22:03

  本文关键词：RNA干扰沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌SiHa细胞自噬的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究针对HPV16 E6基因的小干扰RNA是否能特异性抑制人宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6基因的表达,进一步从自噬体形态和自噬标志物方面观察沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌SiHa细胞中自噬的影响,以探讨HPV病毒感染对细胞自噬的影响,为宫颈癌防治的发展提供新的思路。方法:1.构建并鉴定真核表达载体sh138-HPV16 E6 siRNA。用脂质体法将重组质粒转染至体外培养SiHa细胞中,荧光显微镜动态观察转染情况;用EBSS处理SiHa细胞6h诱导自噬作为饥饿组(阳性对照组);Real-time PCR法检测转染前后各组细胞中HPV16 E6 mRNA表达情况。2.透射电镜观察沉默HPV16 E6基因前后各组细胞中自噬体的形成。同时用免疫细胞化学法检测转染前后各组细胞中Beclin 1蛋白的表达情况。结果:1.重组质粒sh138-HPV16 E6 siRNA的PCR产物凝胶电泳结果和DNA测序图谱分析均证实重组质粒构建成功。将重组质粒用脂质体转染的方法转入宫颈癌SiHa细胞,约12h后在蓝光激发的荧光显微镜下能够察看到些许绿色荧光表达,说明转染成功。约48h后荧光表达程度最强,选择10个200倍视野,计算发出绿色荧光的细胞数和总细胞数的比值,转染效率约为(250±)%。转染48h后实时荧光定量PCR结果表明SiHa-sh138-HPV16 E6 siRNA组细胞中HPV16 E6mRNA表达量明显下降,与SiHa组、饥饿组(阳性对照组)、SiHa-sh138-NC组三者相比,结果具有显著性差异(P0.001)。2.使用透射电镜观察细胞中自噬体的形态和数目,结果表明SiHa-sh138-HPV16 E6 siRNA组中自噬体的数量明显少于SiHa组及SiHa-sh138-NC组(P0.05),饥饿组(阳性对照组)自噬体数量明显多于SiHa组及SiHa-sh138-NC组(P0.05)。3.使用免疫细胞化学的方法检测人宫颈癌SiHa细胞中Beclin 1蛋白的表达情况,结果表明SiHa-sh138-HPV16 E6组中Beclin 1蛋白表达水平明显少于SiHa组及SiHa-sh138-NC组(P0.05),饥饿组(阳性对照组)Beclin 1蛋白表达水平明显高于SiHa组及SiHa-sh138-NC组(P0.05)。结论:1.沉默HPV16 E6基因表达的sh138-HPV16 E6 siRNA重组质粒构建成功。所构建的重组质粒能有效地沉默宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6基因的表达。2.HPV16 E6基因的沉默可明显减少SiHa细胞中自噬体的形成,同时明显下调细胞中Beclin 1蛋白的表达水平。
【关键词】：宫颈癌 小干扰RNA 自噬 HPV16 E6基因
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用缩写词中英文对照表10-11
• 前言11-14
• 第一部分 重组质粒sh138-HPV16 E6 siRNA的构建及鉴定14-33
• 1.材料与方法14-27
• 1.1 实验材料14-16
• 1.2 实验方法16-26
• 1.3 统计学方法26-27
• 2.结果27-32
• 3.讨论32-33
• 第二部分 沉默HPV16 E6基因对SiHa细胞中自噬的影响33-46
• 1.材料与方法33-38
• 1.1 实验材料33-34
• 1.2 实验方法34-37
• 1.3 统计学方法37-38
• 2.结果38-43
• 3.讨论43-45
• 4.结论45-46
• 参考文献46-49
• 综述49-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果59-60
• 个人简历60

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本文编号：405755