宫颈癌SPINT2基因启动子及第1外显子区甲基化状态的研究

发布时间：2017-09-15 11:44

  本文关键词：宫颈癌SPINT2基因启动子及第1外显子区甲基化状态的研究

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【摘要】：持续高危型人乳头瘤病毒的感染已被广泛认为是导致宫颈癌的主要病因,HPV感染后会引起遗传学及表观遗传学的改变,DNA甲基化是宫颈癌发生过程中重要的表观遗传学机制。目的:探讨宫颈癌细胞系及宫颈癌组织中SPINT2基因启动子及第1外显子区甲基化状态及其对表达的影响,并分析SPINT2基因甲基化与宫颈癌临床病理特征的关系。方法:选取HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、SiHa,HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A及50例宫颈癌组织、20例正常宫颈组织作为研究对象。采用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理HeLa细胞系,载有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3细胞系,并用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)以及亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing,BGS)检测宫颈癌细胞系、宫颈组织、5-Aza-CdR处理后的HeLa细胞及慢病毒感染后的HT-3细胞SPINT2基因启动子及第1外显子区甲基化状态,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测其转录表达情况。结果:①细胞系甲基化状态:MSP结果显示HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa细胞系只出现M条带,CaSki、SiHa细胞系出现M+U条带,HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A细胞系只出现U条带,5-Aza-CdR处理后的HeLa细胞出现M+U条带,慢病毒感染后的HT-3细胞仍为U条带。BGS结果显示HeLa细胞系甲基化率为95.1%,CaSki细胞系甲基化率为46.3%,SiHa细胞系甲基化率为32.1%,C-33A细胞系甲基化率为4.9%,而HT-3细胞系中未见甲基化位点,5-Aza-CdR处理后的HeLa细胞甲基化率降为56.0%,慢病毒感染后的HT-3细胞甲基化率为8.8%。②宫颈组织甲基化状态:50例宫颈癌组织中SPINT2基因呈现出3种不同的甲基化状态,其中M型有2例(2/50,4%),M+U型25例(25/50,50%),U型23例(23/50,46%)。而20例正常宫颈组织中仅有5例出现M+U型(5/20,25%),余15例均为U型(15/20,75%)。宫颈癌组织甲基化率高于正常宫颈组织,差异具有统计学意义(P=0.028)。其中HPV阳性宫颈癌组织46例,其甲基化状态为:M型有2例(2/46,4.35%),M+U型25例(25/46,54.35%),U型19例(23/46,50%);4例HPV阴性宫颈癌组织均为U型。HPV阳性宫颈癌组织甲基化率高于HPV阴性宫颈癌组织,差异具有统计学意义(P=0.038)。③SPINT2基因启动子及第1外显子区甲基化率与宫颈癌的分级有相关性(P=0.003),其中G3的甲基化率高于G2,差异具有统计学意义(P=0.001),G1与G2、G1与G3之间的差异无统计学意义。而SPINT2的甲基化与年龄、分期、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移情况、阴道累及情况均无明显相关性(P0.05)。④三种HPV阳性细胞系中SPINT2 mRNA转录表达量较两种HPV阴性细胞系表达量低,表达差异具有统计学意义(P=0.027)。5-Aza-CdR处理前后HeLa细胞中SPINT2基因的转录表达存在显著性差异,处理后为处理前的3.945倍,载有HPV16 E6/E7基因的慢病毒感染HT-3细胞后,SPINT2基因的转录表达量为感染前的0.688倍。⑤宫颈癌组织中mRNA的转录表达量低于正常宫颈组织,表达差异有统计学意义(P=0.032)。⑥发生甲基化的宫颈组织mRNA的转录表达量低于未发生甲基化的宫颈组织,表达差异有统计学意义(P=0.000)。结论:①SPINT2基因启动子及第1外显子区的甲基化率在宫颈癌中明显高于正常宫颈组织。②HPV阳性宫颈癌细胞系甲基化率高于HPV阴性宫颈癌细胞系,HPV阳性宫颈癌组织甲基化率高于HPV阴性宫颈癌组织,表明SPINT2基因甲基化状态可能与HPV的感染有关。③宫颈癌中SPINT2基因启动子及第1外显子区发生甲基化与其mRNA转录表达下调密切相关。④SPINT2基因的甲基化状态与宫颈癌的分级有相关性,在低分化的宫颈癌组织中甲基化率高于中分化组织。
【关键词】：SPINT2 宫颈癌 人乳头瘤病毒 甲基化 5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-7
• 引言7-9
• 第一章 材料与方法9-21
• 1.1 主要仪器、试剂和耗材9-11
• 1.2 宫颈癌细胞系及宫颈组织标本的选择与处理11-12
• 1.3 细胞系总蛋白的提取12
• 1.4 RNA的提取与处理12-13
• 1.5 DNA 提取和焦亚硫酸盐处理13-15
• 1.6 验证慢病毒感染成功15-18
• 1.7 SPINT2 甲基化状态的检测18-19
• 1.8 Real-time q PCR分析SPINT2 基因m RNA的转录表达19-20
• 1.9 统计方法20-21
• 第二章 结果21-31
• 2.1 稳定感染细胞获得及目的基因表达鉴定21-22
• 2.2 SPINT2 基因启动子及第1外显子区甲基化状态的检测结果22-27
• 2.3 Real-time q PCR检测SPINT2 基因的转录表达情况27-31
• 第三章 讨论31-34
• 第四章 结论34-35
• 参考文献35-39
• 综述39-49
• 综述参考文献45-49
• 攻读学位期间研究成果49-50
• 致谢50-51

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本文编号：856337