HPV16 E6、E7介导GSK3β通路对宫颈鳞癌细胞生物学行为的影响及其作用机制研究

发布时间：2017-09-17 23:04

  本文关键词：HPV16 E6、E7介导GSK3β通路对宫颈鳞癌细胞生物学行为的影响及其作用机制研究

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【摘要】：子宫颈癌(cervical cancer,CC),是女性生殖系统发病率最高、最常见的恶性肿瘤。我国作为宫颈癌的高发区域之一,虽经长期的防治,其发病率及死亡率都仍保持较高水平,尤其近20-30年来,发病率及死亡率上升趋势明显。宫颈癌的防治,尤其是预防及早期病变的筛查成为我们的重点工作[1]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)有200余种亚型,据引发生殖道如宫颈及外阴阴道病变的生物学行为将其分为高危型、低危型两大类[2]。现已证实高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌主要的致病因素[3-4]。其中HPV E6、E7蛋白是HPV致癌的主要蛋白[5]。E6、E7分别通过结合并降解抑癌基因P53、pRb发挥细胞的恶性转化功能[6]。但是,仅仅感染HPV并不足以导致宫颈细胞的恶性转化,HPV在宫颈癌发生发展中的具体作用机制仍不清楚。因此探索HPV感染在宫颈癌发生发展中的作用机制,寻找HPV致瘤信号中新的诊治靶点,发现HPV感染致病的信号转导通路,将有助于对筛选的HPV感染人群进行分流管理,并可为宫颈癌早期诊断和靶向治疗提供新的思路,对宫颈癌的防治具有重要意义。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是普遍存在于真核细胞中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,不仅作为一种重要的限速酶参与糖原代谢过程,而且在胚胎发育、肿瘤细胞的凋亡、分化、作为调控转录因子参与多条重要信号传导通路调控等诸多方面发挥着重要作用[7-9]。有关gsk3β与肿瘤关系的研究颇多,但gsk3β在肿瘤发生发展中的作用是促癌还是抑癌仍有较大争议,有学者提出gsk3β对肿瘤的具体作用与肿瘤组织的特异性有关。目前宫颈鳞癌组织中gsk3β的表达及其活性状态鲜有报道。宫颈鳞癌组织中hpv与gsk3β的关系如何?在hpv导致宫颈鳞癌发生发展的过程中,gsk3β扮演了怎样的角色,到目前为止尚不明确。本实验采用(1)免疫组化方法检测了宫颈鳞癌组织中hpv、gsk3β及其磷酸化蛋白(p-gsk3βser9、p-gsk3βtyr216)的表达情况,探讨宫颈鳞癌组织中hpv感染与gsk3β蛋白表达是否存在相关性。(2)以hpve6、e7为目的片段基因,分别构建了hpv16e6、e7、e6/e7重组质粒并测序鉴定。(3)用hpv阴性的宫颈鳞癌细胞株c33a为研究对象,观察hpv16e6、e7、e6/e7重组质粒转染前后宫颈癌细胞c33a的细胞周期、增殖、侵袭、迁移能力等生物学行为的变化。(4)实时荧光定量聚合酶链式反应技术(rt-pcr)、westernblot检测hpv16e6、e7、e6/e7重组质粒转染后对gsk3β及其磷酸化蛋白(p-gsk3βser9、p-gsk3βtyr216)、gsk3β下游靶基因cyclind1和β-catenin蛋白表达的影响。本课题希望通过所设计的研究了解宫颈鳞癌组织中hpv与gsk3β的关系,并在体外实验中进一步探讨hpve6、e7对gsk3β及其磷酸化蛋白、gsk3β下游靶基因cyclind1和β-catenin的调控,为进一步阐明hpv在宫颈癌发生发展中的作用机制提供理论依据。研究结果显示:1.宫颈癌组织中gsk3β、p-gsk3βser9和p-gsk3βtyr216表达阳性率分别为18.8%、68.8%和12.5%。早期宫颈癌患者中gsk3β和p-gsk3βtyr216表达显著高于中晚期宫颈癌患者(25.5%vs.4.0%,χ2=5.193,p=0.029;76.4%vs.52.0%,χ2=4.749,p=0.039),早期宫颈癌患者中p-gsk3βser9表达显著低于中晚期宫颈癌患者(5.5%vs.28.0%,χ2=7.988,p=0.009)。在宫颈癌组织中随着细胞学分级的降低,p-gsk3βser9阳性率也随之升高(7.4%、7.9%和33.3%,χ2=7.329,p=0.031)。淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中gsk3β和p-gsk3βtyr216表达均显著低于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(5.9%vs.28.3%,χ2=6.427,p=0.018;52.9%vs.80.4%,χ2=6.878,p=0.014),p-GSK3βser9在淋巴结转移阳性的宫颈癌患者中表达显著高于淋巴结转移阴性的宫颈癌患者(23.5%vs.4.3%,χ2=6.577,p=0.015)。HPV阳性表达与GSK3β阳性表达呈负相关(相关系数R=-0.392,p=0.001),与p-GSK3βtyr216阳性表达呈正相关(相关系数R=0.275,p=0.026),与p-GSK3βser9阳性表达无相关性。2.HPV E7可显著增加宫颈鳞癌C33A细胞S期比例,提示HPV E7可促进宫颈癌细胞DNA的复制,从而导致肿瘤细胞的恶性转化。HPV E6、E7过表达可显著增强C33A细胞侵袭迁移能力及增殖能力,并且HPV E6、E7两者之间有协同作用。3.HPV E6、E7在较短时间(24h内)可通过GSK3β蛋白磷酸化激活,HPV E6、E7联合对于激活GSK3β蛋白磷酸化具有协同作用。HPV E6、E7通过激活GSK3β蛋白磷酸化发挥对GSK3β下游靶基因CyclinD1、β-catenin基因的调控作用。综上所述,我们初步证实:HPV E6、E7通过激活GSK3β蛋白磷酸化发挥对GSK3β下游靶基因CyclinD1、β-catenin基因的调控作用,从而促进了宫颈癌细胞的侵袭、迁移、增殖能力,导致恶性生物学行为。
【关键词】：宫颈癌 鳞癌 GSK3β HPV 侵袭 迁移 增殖
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-26
• 第一部分 HPV 致病机理的研究进展17-20
• 第二部分 GSK3β 的研究进展20-26
• 实验一GSK3β 及其磷酸化蛋白（p-GSK3βser9、p- GSK3βtyr216）在宫颈鳞癌组织中的表达及其与HPV表达的相关性26-37
• 1 材料26-29
• 2 方法29-31
• 3 结果31-35
• 4 讨论35-37
• 实验二 HPV16 E6、E7及E6/E7重组质粒的构建及鉴定37-64
• 1 材料37-44
• 2 方法44-58
• 3 结果58-62
• 4 讨论62-64
• 实验三 HPV16 E6、E7、E6/E7重组质粒对宫颈癌细胞生物学行为的影响以及对GSK3β 和下游靶基因的调控64-78
• 1 材料64-65
• 2 方法65-69
• 3 结果69-74
• 4 讨论74-78
• 小结78-79
• 参考文献79-85
• 个人简历和研究成果85-87
• 致谢87

【参考文献】

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1 黄彤辉;孙晓红;;Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌形成中的作用机制[J];蛇志;2014年01期

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本文编号：871892