T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠外周NK细胞功能诱导母胎免疫耐受的实验研究

发布时间：2017-09-24 13:24

  本文关键词：T细胞来源Exosomes调节妊娠丢失孕鼠外周NK细胞功能诱导母胎免疫耐受的实验研究

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【摘要】：目的:不明原因反复妊娠丢失(URSA)严重威胁孕妇身心健康,而临床预防治疗URSA的方法尚不完善。目前国内外研究多采用父方淋巴细胞过继免疫诱导受孕母体对胚胎的有效免疫耐受治疗URSA,但此种方法尚存在细胞制备的规范程度不高、各实验室疗效不稳定等不足,限制了在临床上的推广应用。T细胞在生长增殖过程中可分泌释放一种称为Exosomes的膜性微囊结构,前期实验动物研究表明其在改善妊娠丢失孕鼠妊娠结局方面能够产生比细胞治疗更好的效果,并可以克服淋巴细胞免疫治疗的局限性。本研究采用流产实验动物模型,以分析T细胞来源Exosomes过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育、外周NK细胞的影响,旨在探讨非细胞过继免疫诱导母胎免疫耐受的机制,为反复妊娠丢失的免疫治疗开辟新思路。方法:1雄性无关个体脾细胞及其Exosomes的制备:处死BALB/c雄鼠,无菌解剖取脾,获得单个细胞悬液后经刀豆蛋白A(Con A)刺激诱导72h,采用蔗糖密度梯度超速离心联合超滤方法获取exosomes。2妊娠丢失动物模型的建立及实验分组:将雌雄小鼠随机分组后按2:1合笼交配;CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照动物模型(Control组),CBA/J(♀)×DBA/2(♂)为URSA实验动物模型。再将URSA孕鼠随机分为妊娠丢失组(URSA组,孕第4天着床期尾静脉注射生理盐水)、细胞治疗组(Cellular Therapy组,孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾细胞)、非细胞治疗组(Non-cellular Therapy组,孕第4天尾静脉注射无关个体BALB/c雄鼠脾T淋巴细胞来源exosomes)。3观察胚胎发育情况:将各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死,解剖胎盘组织,测量后计算胎盘组织体积,将各组吸收胚胎、存活胚胎分别计数,计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。4孕鼠外周NK细胞表型、表面受体及其效应分子的表达分析:各组CBA/J孕鼠于妊娠第14天分别处死,无菌解剖取脾,制备脾单个核细胞悬液,用直接荧光标记流式细胞技术分别检测NK细胞特征性分化抗原(CD3-CD56+、CDl6+CD56+、CDl6-CD56+)、抑制性及活化性受体(CD56+NKG2A+、CD56+NKG2D+)、活化信号转导分子(CD3-CD247+)以及杀伤效应分子(CD56+Perforin+)的表达百分率。5统计学处理:各组数据均通过SPSS13.0版本软件进行正态性及方差齐性检验。采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况;采用F检验对孕鼠外周NK细胞特征性分化抗原、表面受体、信号转导分子及效应分子的表达进行单因素方差分析(ANOVA),S-N-K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。显著性检验水准α=0.05。结果:1对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响Control组孕鼠的胚胎吸收率为5.78%,URSA组为21.17%,过继转输无关雄鼠细胞治疗组、T细胞来源exosomes的非细胞治疗组分别为6.93%、3.25%。与未经治疗的URSA组相比,细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降(均P0.005),且均下降至Control组水平(均P0.05);非细胞治疗组胚胎吸收率显著低于细胞治疗组(P0.05)。Control组孕鼠的妊娠丢失率为20%,URSA组为64%,细胞治疗组、非细胞治疗组分别为24%、16%。与未经治疗的URSA组相比,细胞及非细胞治疗组妊娠丢失率均显著下降(均P0.005),且均下降至Control组水平(均P0.05);两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P0.05)。2对妊娠丢失孕鼠外周NK细胞免疫功能的影响2.1对NK细胞特征性分化抗原表达的影响Control组孕鼠CD3-CD56+NK细胞表达百分率为(61.92%±4.83%),URSA组细胞百分率为(57.26%±5.44%);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后分别为(66.86%±6.76%,60.84%±6.88%);妊娠各组的组间比较均无明显统计学意义(P0.05)。与Control组孕鼠CD16-CD56+NK细胞百分率(56.33%±4.10%)相比,URSA组细胞百分率明显下降为(43.98%±4.63%,P0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后显著回升(分别为60.14%±4.98%,54.77%±6.74%,均P0.01)至Control组水平(均P0.05)。两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P0.05)。与Control组孕鼠CD16+CD56+NK细胞百分率(6.39%±1.22%)相比,URSA组细胞百分率明显升高为(13.28%±1.40%,P0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后降低(分别为4.73%±1.32%,6.07%±0.84%,均P0.01)至Control组水平(均P0.05)。两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P0.05)。2.2对NK细胞抑制性及活化性受体的影响与Control组孕鼠CD56+NKG2A+NK细胞表达率(1.42%±0.44%)相比,URSA组阳性细胞表达率显著下降为(0.35%±0.09%,P0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率回升(分别1.36%±0.30%、4.91%±0.99%,均P0.01);两治疗组组间比较有统计学意义(P0.05)。Control组孕鼠CD56+NKG2D+NK细胞表达率为(1.29%±0.38%),URSA组阳性细胞表达率为(1.44%±0.22%);细胞治疗以及非细胞治疗组分别为(1.16%±0.41%、1.37%±0.26%);妊娠各组组间比较均无统计学意义(P0.05)。2.3对NK细胞活化信号转导分子表达的影响与Control组孕鼠CD3-CD247+NK细胞表达率(3.93%±1.32%)相比,URSA组阳性细胞表达率下降显著(0.14%±0.06%,P0.01);在经过细胞治疗后阳性细胞表达率升高(1.36%±0.30%,P0.01)至Control组水平(均P0.05);在经过非细胞治疗后阳性细胞表达率(0.42%±0.18%)与URSA组无明显统计学意义(P0.05)。2.4对NK细胞杀伤效应分子表达的影响与Control组孕鼠CD56+Perforin+NK细胞表达率(7.99%±2.51%)相比,URSA组阳性细胞表达率升高显著(11.44%±2.78%,P0.01);在经过细胞治疗以及非细胞治疗后阳性细胞表达率降低(分别为7.51%±1.27%,8.12%±1.32%,均P0.01)至Control组水平(均P0.05);两治疗组的组间比较无明显统计学意义(P0.05)。.结论:1过继转输无关雄性个体外周淋巴细胞或T细胞来源的非细胞成分Exosomes均可有效诱导母胎间免疫耐受,有利于正常妊娠。且Exosomes治疗能够发挥比外周淋巴细胞治疗更强的改善妊娠结局的效应。2过继转输无关雄性个体外周淋巴细胞及T细胞来源Exosomes可引发孕鼠外周NK细胞特征性分化抗原、表面受体、活化信号转导分子及效应分子的表达变化,从而有效诱导母胎免疫耐受。3过继转输无关雄性个体外周淋巴细胞与T细胞来源Exosomes相比,细胞及非细胞治疗通过调节妊娠丢失孕鼠外周NK细胞免疫功能诱导母胎免疫耐受的程度水平有所不同,细胞治疗可使活化信号转导分子表达升高,而非细胞治疗对其无影响;两者均可使抑制性受体显著升高,但非细胞治疗升高更显著。
【关键词】：妊娠丢失 过继转输 T细胞来源Exosomes NK细胞 母胎免疫耐受 小鼠
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.2
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-19
• 结果19-21
• 附图21-29
• 附表29-31
• 讨论31-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 综述 蜕膜NK细胞调节正常妊娠的机制研究进展41-57
• 参考文献48-57
• 致谢57-58
• 个人简历58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李睿;王宗军;张业霞;李泽武;;主动免疫治疗习惯性流产的疗效研究[J];泰山医学院学报;2011年03期

2 杜美蓉;徐冰;朴海兰;李大金;;人早孕期蜕膜基质细胞下调蜕膜NK细胞杀伤活性[J];现代免疫学;2012年04期

3 姜培娟;林其德;赵爱民;鲍世民;肖世金;;IL-4与IL-10联合免疫对趋化因子受体CCR3、CCR5、CXCR3的选择性诱导对自然流产模型小鼠胚胎丢失率的影响[J];现代妇产科进展;2009年05期

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中国硕士学位论文全文数据库 前2条

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本文编号：911679