卵巢癌SKOV3中Holoclone细胞的特性及其形成血管生成拟态的能力

发布时间：2017-09-25 10:57

  本文关键词：卵巢癌SKOV3中Holoclone细胞的特性及其形成血管生成拟态的能力

  更多相关文章： 卵巢上皮性癌 单细胞克隆 血管生成拟态 三维细胞培养 基质金属蛋白酶

【摘要】：目的:血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是高侵袭性的肿瘤细胞所具有的自我血供的微循环结构,利用人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3分离培养3种不同形态的单细胞克隆,比较其体内成瘤能力及体外克隆形成能力,并计算克隆形成率(colony forming efficiency,CFE);观察其形成VM的能力;并检测肿瘤干细胞标记物CD133和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9的表达水平。方法:1通过有限稀释法对SKOV3进行单细胞培养形成3种不同形态的单细胞克隆:全克隆(holoclone)、部分克隆(meroclone)、亚克隆(paraclone);Holoclone细胞紧密排列体积小,圆形或椭圆形,具有连续传代、无限增殖等干细胞特性;Paraclone细胞形状不规则,松散,可能为终末分化细胞;Meroclone介于holoclone和paraclone之间。取对数生长期的SKOV3细胞,用梯度倍数稀释的原则,将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度(每个96孔板中含0.5-1个细胞)。次日,挑选并标记只含1个细胞的孔;培养10-14天后孔中即形成较大克隆,区分并标记各种形态不同的细胞克隆。继续培养进行细胞后续实验。实验重复3次。2体内成瘤能力的试验:将30只雌性裸鼠(BALB/c-nu)随机分成3组分别接种3种不同形态的细胞。无菌条件下,将holoclone细胞计数1000个,meroclone细胞和paraclone细胞计数分别为1×105个,分别重悬于0.2ml PBS中,接种于裸鼠右侧大腿皮下,观察裸鼠皮下成瘤情况。实验重复3次。3软琼脂克隆形成实验:制备单细胞悬液,将holoclone,meroclone,paraclone分别接种在软琼脂上,培养箱内培养2~3周。镜下计数含50个细胞以上的克隆,并计算CFE。实验重复3次。4三维细胞培养:将holoclones细胞,meroclones和paraclones细胞分别接种于用于进行三维细胞培养的人工基底膜基质胶Matrigel上。利用倒置相差显微镜随机取上、下、左、右、中心5个视野,间隔相同的时间观察VM形成情况,并拍照记录。实验重复3次。5 Western Blot方法检测MMP-2、MMP-9和CD133的表达。实验重复3次。结果:1细胞单克隆的筛选将SKOV3细胞利用有限稀释法将稀释的细胞接种于96孔板。接种24 h后,挑选并标记只含有1个细胞的孔。继续培养10-14d后,区分细胞克隆的形态及分类并计数(此部分实验由两个人进行确认)。Holoclone细胞均呈圆形或椭圆形,细胞密集整齐排列,形态规则,其所含的细胞体积小,胞浆较少,无明显伪足或突起。Paraclone细胞形状不规则,松散,体积也较大,细胞含有丰富的胞浆,可见明显伪足或突起。Meroclone形态位于holoclone和paraclone中间,不如holoclone规则,内部的细胞排列相对均匀,体积也较小,细胞排列趋向松散,周边的细胞可以出现伪足。本实验重复3次,计算3种克隆的平均比例,holoclone为17.4±0.8%,meroclone为30.1±0.4%,paraclone为52.5±1.1%。在相同培养条件下,观察10周左右,holoclone可以快速增殖,连续传代,meroclone及paraclone大部分消失。观察12周左右,holoclone仍保持快速增值,可以连续传代,仅存的小部分meroclone及paraclone全部发生凋亡或无法继续传代。观察16周左右holoclone的形态与母系SKOV3细胞形态相似,呈对数生长。后续实验均使用培养12周之前的细胞。2体内成瘤能力的分析将1000个holoclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,观察7-10天后,平均成瘤率为80%。将1×105个meroclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,持续观察6周后,未见雌性裸鼠成瘤。将1×105个paraclone细胞接种于雌性裸鼠大腿皮下,持续观察6周后,未见雌性裸鼠成瘤。3克隆形成率软琼脂克隆形成实验结果:Holoclone细胞CFE为16.7±3.8%;meroclone细胞CFE为6.5±1.5%;但paraclone细胞CFE非常低,仅仅为1.2±0.7%(P0.05)。Holoclone细胞CFE比meroclone细胞和paraclone细胞CFE约增加二倍至十倍。4三种单细胞克隆形成VM的能力在三维细胞培养条件下,holoclone在6 h即形成典型的VM管状样结构,12 h达到高峰,72 h后此结构开始松散凋落。然而meroclone和paraclone未形成VM。5 Western blot方法检测CD133及MMP-2、MMP-9的蛋白表达Holoclone组CD133蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P0.05 F=33.524)。Holoclone组MMP-2蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P0.05 F=11.641)。Holoclone组MMP-9蛋白表达水平显著高于母系SKOV3组,同时也高于meroclone和paraclone组(P0.05 F=14.336),差异有统计学意义。结论:1人卵巢癌细胞系SKOV3中不同单细胞克隆在形态和分化上存在异质性,其中holoclone细胞具有较高的体内成瘤率及体外克隆形成率,且高表达CD133,具有肿瘤干细胞样细胞特性。2 Holoclone具有形成VM能力,为卵巢恶性肿瘤的转移及复发提供充足的血液供应,其机制可能与MMPs诱导细胞外基质重塑及肿瘤的高侵袭力有关,有助于深入理解卵巢癌侵袭及复发的机制。
【关键词】：卵巢上皮性癌 单细胞克隆 血管生成拟态 三维细胞培养 基质金属蛋白酶
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-23
• 结果23-25
• 附图25-29
• 附表29-30
• 讨论30-32
• 结论32-33
• 参考文献33-36
• 综述 肿瘤干细胞与血管生成拟态关系的研究36-48
• 参考文献42-48
• 致谢48-49
• 个人简历49

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张凡;孙保存;赵秀兰;常永霞;;小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化[J];河北北方学院学报;2005年05期

2 孙保存;张诗武;赵秀兰;郝希山;;双向分化恶性肿瘤血管生成拟态分子机制初步研究[J];医学研究通讯;2005年09期

3 黄海波;韩振国;辛华;;血管生成拟态研究进展[J];吉林大学学报(医学版);2008年01期

4 李宏伟,王奕飞,马勇;恶性黑色素瘤血管生成拟态动物实验模型的建立及形态学观察[J];武警医学院学报;2004年04期

5 尚政军,李金荣,赵怡芳;肿瘤血管生成拟态[J];国外医学.口腔医学分册;2005年04期

6 张诗武;孙保存;;肿瘤血管生成拟态研究进展[J];中华病理学杂志;2007年10期

7 孔祥琳;程先硕;杨之斌;李云峰;;上皮间质转化在血管生成拟态中的研究进展[J];肿瘤防治研究;2014年04期

8 郝希山,孙保存,张诗武,赵秀兰;双向分化肿瘤血管生成拟态的分子机制初步观察[J];中华肿瘤杂志;2003年06期

9 赵静;黄江生;杨爱军;王晨昱;刘伟;李敏;;肝细胞癌中血管生成拟态的三维细胞培养及组织学研究[J];癌症;2007年02期

10 王华民;杨学军;;血管生成拟态及其在胶质瘤中的研究进展[J];中国神经肿瘤杂志;2011年02期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 孟立祥;荚卫东;许戈良;李建生;黄河;高群;马金良;;肝癌细胞血管生成拟态体外研究[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

2 陈忠平;;胶质瘤血管生成拟态的分子靶点探讨[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

3 岳伟英;陈忠平;;星形胶质细胞肿瘤中有肿瘤血管生成拟态现象吗?[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

4 陈忠平;;胶质瘤中的血管生成拟态现象和意义[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年

5 张诗武;孙保存;张丹芳;郭华;赵秀兰;;黑色素瘤细胞线形程序性坏死与血管生成拟态之间关系的形态学观察研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

6 陈银生;陈忠平;;胶质瘤干细胞血管生成拟态的分子机制研究[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

7 孙保存;张诗武;赵秀兰;倪春生;刘岩雪;邱志强;郝希山;;双向分化恶性肿瘤血管生成拟态分子机制初步研究[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

8 李熳;谷彦军;张丹芳;赵秀兰;孙保存;;胃腺癌血管生成拟态的临床病理意义及其相关机制研究[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年

9 孙保存;;肿瘤血管生成拟态:进展与挑战[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 刘道安 李运红 赵迎;恶性肿瘤血供方式新发现——血管生成拟态[N];健康报;2006年

2 刘道安 李运红 赵迎;双向分化恶性肿瘤存在血管生成拟态[N];中国医药报;2006年

3 记者　冯国梧 通讯员　李运红赵迎;恶性肿瘤血道转移之谜揭开[N];科技日报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王世勇;恶性神经上皮肿瘤的血管生成拟态及其对患者预后的影响分析[D];南方医科大学;2013年

2 王巍;血管生成拟态在喉癌中的临床意义分子机制的初步探讨[D];天津医科大学;2010年

3 杜静;缺氧在卵巢癌血管生成拟态形成中的作用研究[D];天津医科大学;2012年

4 刘文斌;肝细胞癌血管生成拟态的临床意义及分子机制研究[D];天津医科大学;2011年

5 朱芳;PI3K作为抗肺癌血管新生和血管生成拟态共同靶点的研究[D];华中科技大学;2010年

6 凌耿强;转化生长因子-β基因沉默抑制U251MG细胞形成血管生成拟态的实验研究[D];南方医科大学;2012年

7 黄敏;mTOR经HIF-1α调控脑胶质瘤血管生成拟态的机制研究[D];南方医科大学;2014年

8 秦亮;骨髓间充质干细胞对前列腺癌血管生成拟态的影响及前列腺癌骨转移相关机制的初步研究[D];华中科技大学;2014年

9 阮莎莎;Semaphorin4D对非小细胞肺癌血管生成拟态形成及迁移侵袭能力的影响[D];华中科技大学;2014年

10 李建文;HIF-1α抑制剂YC-1对缺氧条件下U87细胞血管生成拟态的影响[D];南方医科大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 杨立芬;卵巢癌SKOV3中Holoclone细胞的特性及其形成血管生成拟态的能力[D];河北医科大学;2015年

2 陈琳;低剂量节拍化疗对卵巢癌细胞SKOV3血管生成拟态的影响及其机制的探讨[D];河北医科大学;2015年

3 杨峥;食管鳞癌血管生成拟态初步研究[D];泸州医学院;2010年

4 张凡;小鼠黑色素移植瘤模型中血管生成拟态形成的时空变化及其分子机制的初步观察[D];天津医科大学;2004年

5 胡晔;大鼠诱发性肝癌模型中血管生成拟态现象观察及其形成机制研究[D];安徽医科大学;2010年

6 董娜;肺癌血管生成拟态的研究及与凋亡关系的初步探讨[D];天津医科大学;2010年

7 孟康;沖鱼软骨多糖对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的时空变化及相关因子的影响[D];辽宁医学院;2013年

8 张诗武;黑色素瘤血管生成拟态分子机制的研究[D];天津医科大学;2003年

9 安丹;E-钙粘蛋白在肝细胞肝癌血管生成拟态中的表达[D];华中科技大学;2008年

10 周腾;肝细胞癌血管生成拟态形成机制的实验研究[D];安徽医科大学;2012年

，

本文编号：916968