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虾青素在香烟烟雾提取物诱导气道上皮MUC5AC高分泌中的作用

发布时间:2017-09-05 13:22

  本文关键词:虾青素在香烟烟雾提取物诱导气道上皮MUC5AC高分泌中的作用


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【摘要】:背景:气道黏液高分泌是慢性气道疾病的重要病理特征。黏蛋白是维持气道黏液黏弹性的主要成分,MUC5AC是病理状态下气道主要的分泌蛋白。吸烟是慢性气道疾病主要危险因素。香烟中活性氧激活EGFR,顺次激活下游信号通路,诱导黏蛋白MUC5AC高表达。虾青素是类胡萝卜素的一种,具有极强的抗氧化活性,可以清除氧自由基,抑制ROS的产生。基于ROS在气道黏蛋白MUC5AC高分泌中的作用及虾青素的抗氧化活性,我们探讨虾青素对香烟烟雾提取物诱导气道黏蛋白MUC5AC的作用。 目的:探讨虾青素对香烟烟雾提取物诱导气道黏蛋白MUC5AC高分泌的作用及相关机制。 方法:(1)体外培养A549细胞,利用香烟烟雾提取物构建气道黏蛋白MUC5AC高分泌模型。MTT法检测虾青素对于细胞增殖的影响,确定虾青素的浓度。给予不同浓度的香烟烟雾提取物.(2.5%、5%、10%)刺激A549细胞24小时,采用RT-PCR检测MUC5ACmRNA变化,ELISA检测MUC5AC蛋白变化。确定构建模型成功后,将细胞分为5组:阴性对照组、模型组、模型+8uM ATX组、模型+16uM ATX组、模型+32uM ATX组;分别采用RT-PCR法及ELISA法检测MUC5AC基因转录及蛋白表达情况。(2)将细胞分为5组:阴性对照组、模型组、模型+ATX (32uM)组、模型+DMTU (20uM)组、模型+ATX+DMTU组。多功能酶标仪检测细胞内ROS变化、RT-PCR检测MUC5AC基因转录变化,ELISA法检测MUC5AC蛋白表达变化,Western blot法检测EGFR、p-EGFR变化。 结果:(1)成功构建香烟烟雾提取物诱导气道黏蛋白MUC5AC高分泌模型;不同浓度香烟烟雾提取物刺激A549细胞24小时后,MUC5ACmRNA及蛋白表达增加,且呈浓度依赖性。MTT结果显示,虾青素浓度低于32uM时对于细胞增殖作用较弱,当虾青素浓度达到64uM时,细胞增殖抑制率超过50%,所以选择8uM、16uM.32uM三个浓度为实验浓度。不同浓度虾青素干预后可以明显降低香烟烟雾提取物诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达。(2)与模型组相比,虾青素(32uM)干预组可以明显降低细胞内ROS含量,Western blot结果显示EGFR、p-EGFR含量也明显降低。 结论:(1)香烟烟雾提取物可以刺激气道上皮细胞MUC5AC基因转录和蛋白表达,而虾青素可以降低香烟烟雾诱导的MUC5AC基因转录和蛋白表达(2)虾青素降低香烟烟雾提取物诱导的MCU5AC基因转录和蛋白表达可能是通过抑制ROS产生,抑制EGFR磷酸化发挥作用的。
【关键词】:香烟烟雾提取物 黏蛋白 虾青素 MUC5AC
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R562
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-11
  • ~.略语表11-12
  • 1 前言12-14
  • 2 材料和方法14-28
  • 2.1 主要仪器14
  • 2.2 主要材料14-15
  • 2.3 主要试剂15-16
  • 2.4 主要试剂的配制方法16
  • 2.4.1 MTT工作液的配制16
  • 2.4.2 虾青素溶液的配制16
  • 2.4.3 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制16
  • 2.4.4 PCR引物溶液的配制16
  • 2.5 实验方法16-18
  • 2.5.1 香烟烟雾提取物的制备16-17
  • 2.5.2 细胞培养技术和方法17-18
  • 2.6 MTT法检测香烟提取物及虾青素对于细胞增殖的影响18-19
  • 2.6.1 MTT法检测香烟烟雾提取物对于细胞增殖的影响18-19
  • 2.6.2 MTT法检测虾青素对于细胞增殖的影响19
  • 2.7. 细胞处理及分组19-20
  • 2.7.1 不同浓度的香烟烟雾提取物刺激A549细胞19
  • 2.7.2 不同浓度的虾青素干预分组19-20
  • 2.8 蛋白定量20
  • 2.9 ELISA法检测细胞上清液中MUC5AC的含量20-21
  • 2.10 RT-qPCR检测细胞中MUC5ACmRNA含量变化21-23
  • 2.10.1 trizol法提取细胞中总RNA21-22
  • 2.10.2 逆转录合成cDNA22
  • 2.10.3 PCR仪扩增22-23
  • 2.11. ROS试剂盒检测ROS23
  • 2.11.1 实验分为5组23
  • 2.11.2 细胞内ROS的检测23
  • 2.12. western blot检测细胞中EGFR、p-EGFR蛋白表达情况23-25
  • 2.12.1 实验分组同上,处理完成后提取蛋白23-24
  • 2.12.2 蛋白定量:同前24
  • 2.12.3 电泳24
  • 2.12.4 转膜24-25
  • 2.12.5 封闭25
  • 2.12.6 一抗孵育25
  • 2.12.7 二抗孵育25
  • 2.12.8 显影25
  • 2.13 试验流程图25-27
  • 2.14 统计学分析27-28
  • 3 结果28-35
  • 3.1 不同浓度香烟烟雾提取物,在不同时间对于细胞增殖的影响28
  • 3.2 不同浓度虾青素刺激细胞24小时对于细胞增殖的影响28-29
  • 3.3 不同浓度香烟烟雾提取物溶液对于MUC5ACmRNA及蛋白分泌的影响29-31
  • 3.4 不同浓度虾青素对香烟烟雾提取物诱导黏蛋白MUC5AC高分泌的影响31-32
  • 3.5 虾青素及DMTU抑制CSE诱导气道粘蛋白MUC5AC基因转录及蛋白表达32
  • 3.6 虾青素对香烟烟雾提取物刺激A549细胞24h后ROS含量变化的影响32-33
  • 3.7 虾青素对香烟烟雾提取物刺激细胞24后EGFR、p-EGFR蛋白变化的影响33-35
  • 4 讨论35-37
  • 4.1 气道黏液高分泌模型的建立35
  • 4.2 虾青素对于香烟烟雾提取物诱导气道黏蛋白MUC5AC高分泌具有抑制作用35-36
  • 4.3 虾青素通过ROS/EGFR通路抑制CSE诱导的A549细胞MUC5AC高分泌36-37
  • 5 结论37-38
  • 参考文献38-42
  • 综述42-53
  • 参考文献47-53
  • 致谢53

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Shi-Yong Sun;;Impact of genetic alterations on mTOR-targeted cancer therapy[J];Chinese Journal of Cancer;2013年05期

2 刘换新;白义凤;王炜;郭琳琅;;LRIG1和EGFR mRNA在非小细胞肺癌患者外周血中的表达及其临床意义[J];吉林大学学报(医学版);2014年02期

3 冯涛;嵇武;;肠道干细胞标记物的研究进展[J];肠外与肠内营养;2014年02期

4 徐辰鸣;邱建新;;分子靶向药物在晚期肾癌个体化治疗中的应用[J];世界临床药物;2014年03期

5 陶虹;郭丽丽;唐俊舫;朱允中;徐丽艳;孟弃逸;武玮;李明智;吴卫华;仝丽;吴洪波;史亮;刘U,

本文编号:798216


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